一種供hplc分析用林可黴素發酵液的前處理方法

2023-04-25 11:06:21 5

專利名稱：一種供hplc分析用林可黴素發酵液的前處理方法
技術領域：
本發明涉及一種發酵液進行高效液相色譜法檢測的前處理方法，尤其涉及一種供 HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法。
背景技術：
林可黴素屬於林可黴素類抗生素，對大多數革蘭氏陽性菌及某些厭氧的革蘭氏陰性菌有效，對陽性菌的作用類似紅黴素。主要用於厭氧菌引起的腹腔和婦科感染，也常用於敏感陽性菌所致的各種嚴重感染，因它濃集於骨組織，故為金葡骨髓炎的首選藥，其在臨床上應用較為廣泛。林可黴素的組分包括林可黴素及其B組分，其中B組分為雜質組分，目前林可黴素發酵液單位的檢測最常用的為生物檢測或旋光法檢測，均無法對林可黴素B組分進行檢測。相對於生物檢測或旋光法檢測，高效液相色譜法(HPLC)具有快速、準確、林可黴素B組分的量能直觀比較的優點，特別是在林可黴素菌種選育時搖瓶發酵液的檢測上表現更為突出，有利於優選出林可黴素B組分低的菌種，其應用也日益廣泛。在應用HPLC法檢測發酵液單位中，發酵液前處理方法的優劣對檢測結果的準確性、色譜柱的損傷程度以及檢測效率影響較大，因而對發酵液前處理方法的改進與提高很有意義。現有技術中，林可黴素發酵液前處理技術(張朝正等，多元萃取體系分離發酵液中林可黴素的過程研究，中國科學院上海冶金研究所；材料物理與化學(專業)博士論文 2000年度)是發酵液經複合萃取劑、pH為10. 5、溫度為常溫、相比r (0/A)=0. 5條件下多元萃取，一級萃取收率可達到92%以上。此林可黴素發酵液前處理方法缺點在於過程複雜， 需進行多元萃取，萃取不完全，只能測定萃取相中林可黴素含量，從而影響測定的準確性， 效率比較低。

發明內容
本發明的目的在於提供一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，旨在提高HPLC分析林可黴素發酵液單位及林可黴素B組分的準確性，提高液相色譜柱的分離效果和使用壽命。本發明的目的是通過以下技術方案予以實現的
一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，所述方法包括如下步驟
1)將林可黴素發酵液進行離心分離去除菌絲體與固體雜質得上清液；
2)將步驟I)所得上清液與乙醇按1:2 4體積比混合均勻，通過離心分離析出水溶性蛋白質後得到的清液即可作為樣品用於高效液相色譜法(HPLC)分析林可黴素及B組分含量。為進一步除去微小的顆粒雜質，所述步驟2)中離心分離後得到的清液用孔徑為 O. 22 μ m O. 45 μ m偏氟膜(F膜)過濾。優選的，所述步驟2)中將步驟I)所得上清液與乙醇以1:4的體積比混合均勻，可以除去很大一部分不溶於乙醇水溶液的雜質,使離心液中含有的水溶性蛋白質變性析出，從而被離心除去，有利於提高色譜柱的使用壽命。所述步驟I)中離心分離的條件為4000 10000r/min下離心10 15分鐘,步驟
2)中離心分離的條件為6000 12000r/min下離心10 20分鐘。優選的，步驟2)中離心分離後得到的清液用孔徑為O. 22 μ m偏氟膜(F膜)過濾。優選的，所述步驟I)中的離心時間為10分鐘。優選的，所述步驟2)中的離心時間為15分鐘。本發明中，所述的林可黴素發酵液是指任何產林可黴素的菌株在適當的條件下發酵產生出來的林可黴素發酵液。本發明的有益效果是通過本方法對林可黴素發酵液處理後，供HPLC分析的樣品中的雜質大大降低，林可黴素與林可黴素B組分及相鄰峰均能有效分離，連續進行數百個樣品分析，未見柱壓明顯升高，色譜柱的理論塔板數符合檢測要求，分析效果良好。
具體實施例方式實施例I :
取林可黴素生產發酵液，於4000r/min離心10分鐘，去除菌絲體與固體雜質，吸取上清液，按體積比1:2加入乙醇，混合均勻，在6000r/min條件下離心20分鐘；然後用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾後的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可黴素，《中華人民共和國藥典》(2010)二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續分析50個樣品後，柱壓為1298 1334psi， 林可黴素峰的理論塔板數為6800 7500 ;林可黴素與林可黴素B組分分離度大於14，與相鄰的色譜峰分離度大於9，分析前後，柱壓略有升高，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數沒有明顯變化。實施例2:
取林可黴素生產發酵液，於4000r/min離心15分鐘，去除菌絲體與固體雜質，吸取上清液，按體積比1:3加入乙醇，混合均勻，在6000r/min條件下離心20分鐘；然後用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾後的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可黴素，《中華人民共和國藥典》(2010)二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續分析50個樣品後，柱壓為1316 1343psi， 林可黴素峰的理論塔板數為6800 7500 ;林可黴素與林可黴素B組分分離度大於14，與相鄰的色譜峰分離度大於9，分析前後，柱壓沒有明顯變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數未下降。實施例3:
取林可黴素生產發酵液，於6000r/min離心15分鐘，去除菌絲體與固體雜質，吸取上清液，按體積比1:4加入乙醇，混合均勻，在10000r/min條件下離心15分鐘；然後用O. 22 μ m 偏氟膜過濾；過濾後的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可黴素，《中華人民共和國藥典》(2010)二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續分析50個樣品後，柱壓為1320 1337psi， 林可黴素峰的理論塔板數為6800 7500 ;林可黴素與林可黴素B組分分離度大於15，與相鄰的色譜峰分離度大於9，分析前後，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數未下降。實施例4:
取林可黴素菌種選育搖瓶發酵液，於8000r/min離心10分鐘，去除菌絲體與固體雜質，吸取上清液，按體積比1:3加入乙醇，混合均勻，在80000r/min條件下離心17分鐘；然後用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾後的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可黴素《中華人民共和國藥典》(2010) 二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續分析80個樣品後，柱壓為 1330 1361psi，林可黴素峰的理論塔板數為6800 7500 ;林可黴素與林可黴素B組分分離度大於14，與相鄰的色譜峰分離度大於9，分析前後，柱壓沒有明顯變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數未下降。實施例5:
取林可黴素菌種選育搖瓶發酵液，於lOOOOr/min離心10分鐘，去除菌絲體與固體雜質，吸取一定量的上清液，按體積比1:4加入乙醇，混合均勻，在12000r/min條件下離心10 分鐘；然後用O. 22 μ m偏氟膜過濾；過濾後的清液供HPLC檢測(HPLC檢測條件同鹽酸林可黴素《中華人民共和國藥典》(2010) 二部第727頁)，該HPLC色譜柱連續分析120個樣品後，柱壓為1328 1357psi，林可黴素峰的理論塔板數為6800 7500 ;林可黴素與林可黴素B組分分離度大於15，與相鄰的色譜峰分離度大於9，分析前後，柱壓沒有變化，HPLC的分析效果良好，主峰的理論塔板數未下降。上述實施例僅是本發明的較佳實施方式，詳細說明了本發明的技術構思和實施要點，並非是對本發明的保護範圍進行限制，凡根據本發明精神實質所作的任何簡單修改及等效結構變換或修飾，均應涵蓋在本發明的保護範圍之內。
權利要求
1.一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，所述方法包括以下步驟.1)將林可黴素發酵液進行離心分離去除菌絲體與固體雜質得上清液；.2)將步驟I)所得上清液與乙醇按1:2 4體積比混合均勻，通過離心分離析出水溶性蛋白質後得到的清液即可供HPLC分析使用。
2.根據權利要求I所述的一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，所述步驟2)中離心分離後得到的清液用孔徑為O. 22 μ m O. 45 μ m偏氟膜過濾。
3.根據權利要求I所述的一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，所述步驟2)中將步驟I)所得上清液與乙醇按1:4的體積比混合均勻。
4.根據權利要求I或2所述的一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，所述步驟I)中離心分離的條件為4000 10000r/min下離心10 15分鐘,步驟2)中離心分離的條件為6000 12000r/min下離心10 20分鐘。
5.根據權利要求2所述的一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，步驟2)中離心分離後得到的清液用孔徑為O. 22 μ m偏氟膜過濾。
6.根據權利要求4所述的一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，所述步驟I)中的離心時間為10分鐘。
7.根據權利要求4所述的一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，其特徵在於，所述步驟2)中的離心時間為15分鐘。
全文摘要
本發明公開一種供HPLC分析用林可黴素發酵液的前處理方法，該方法包括如下步驟1)將林可黴素發酵液離心分離得上清液；2)將上清液與乙醇以1:2～4體積比混合均勻，離心分離析出水溶性蛋白質後得到的清液即可用於HPLC分析。使用該方法預處理髮酵液後，供HPLC分析的樣品中的雜質大大降低，用於林可黴素發酵液檢測，林可黴素組分及其B組分均與相鄰雜質峰有效分離，分析效果好，林可黴素B組分能直觀的用數據表現出來，分析準確率高，連續進行數百個樣品分析，未見柱壓明顯升高，色譜柱理論塔板數能滿足檢測要求。
文檔編號G01N30/06GK102590395SQ20121001053
公開日2012年7月18日 申請日期2012年1月14日 優先權日2012年1月14日
發明者劉瑞華, 姚健, 李為全, 營麗, 陳倩倩 申請人:安徽省皖北藥業股份有限公司