分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用的製作方法

2023-04-25 11:54:16 2

分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種犬p27單克隆抗體的製備及其應用。本發明提供了一種保藏號為CGMCCNO.9457的小鼠雜交瘤細胞3G8，還提供了由保藏號為CGMCCNO.9457的小鼠雜交瘤細胞3G8產生的單克隆抗體。本發明所述的雜交瘤細胞3G8分泌的單克隆抗體具有良好反應活性，可應用於犬乳腺腫瘤組織中p27蛋白的檢測，解決了目前的檢測難題，為其在犬乳腺腫瘤以及其他疾病的深入研究奠定基礎，為臨床上相應的治療及預後提供了有效手段。
CGMCCNo.9457
2014.07.15
【專利說明】分泌犬027單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用

【技術領域】
[0001]本發明涉及一種分泌犬？27單克隆抗體的雜交瘤細胞株及其應用，屬於生物【技術領域】。

【背景技術】
[0002]￠27蛋白作為細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(161)611(16111: 1^111886
0(18),通過與各種細胞周期素-細胞周期素依賴性激酶(0701111-⑶10複合物作用發揮廣譜的抑制0)1(的活性，調控細胞周期的進程，具有誘導細胞分化、促進凋亡、調節腫瘤耐藥性等功能，其活性的改變與細胞凋亡的發生存在明顯相關性。前期的研究結果表明，惡性腫瘤中？27表達量顯著降低，證明1)27蛋白與腫瘤的發生與轉移存在明顯的相關性，它也被認為是具有潛在價值的獨立預後因子。進一步對？27蛋白生物學功能的機制研究成為當前熱點。
[0003]人類乳腺腫瘤以及其他的腫瘤細胞系過表達？27不僅誘導細胞周期阻滯和 ⑶1(的活性降低，還能有效的促進細胞凋亡發生。犬乳腺腫瘤是獸醫臨床上常見的疾病，其發病率呈逐年上升趨勢，對犬的健康構成嚴重危害，尋求犬乳腺腫瘤診斷及預防的關鍵靶點是當前的研究熱點。因生活及飲食習慣更和人類接近，相比於鼠，犬是更為理想的實驗動物模型，對於犬腫瘤的研究不僅對獸醫臨床有重要價值，對於人醫腫瘤臨床的研究也同樣具有重要意義。市面上銷售的針對？27蛋白的抗體均為針對人源或者鼠源，沒有針對犬源的，所以本發明製備犬27單克隆抗體，使人們能開展？27與犬乳腺腫瘤的相關研究具有重要意義。


【發明內容】

[0004]本發明的目的是提供一種分泌犬？27單克隆抗體的雜交瘤細胞株，該細胞株分泌的犬？27單克隆抗體能夠應用於犬乳腺腫瘤病理組織樣品中1)27蛋白的檢測。
[0005]本發明的目的是通過如下技術方案實現的:
[0006]本發明所提供的雜交瘤細胞株為能夠分泌犬]327單克隆抗體，該雜交瘤細胞株已於2014年7月15日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱06100 」，保藏號為9457。地址:北京市朝陽區北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵政編碼:100101。該雜交瘤細胞株的建立是利用原核表達技術，表達犬？27蛋白為抗原，免疫8八18八小鼠，利用淋巴胞雜交瘤技術建立的特異單克隆抗體雜交瘤細胞庫獲得的。用該雜交瘤細胞製備的單克隆抗體，經免疫組織化學染色證明，此單克隆抗體能有效的結合犬細胞內？27蛋白。間接實驗表明:雜交瘤細胞培養液上清效價1:: 6400。本發明的特點如下:
[0007]1.本發明使用的免疫原是從經奶-？0？方法克隆的犬？27基因，利用原核表達技術製備的犬]327蛋白。
[0008]2.本發明所製備的單克隆抗體是針對犬種屬1)27蛋白，具有種屬特異性，免疫組化實驗證明其有效的和犬腫瘤細胞中的p27蛋白結合，根據其結果可以對犬腫瘤患犬的診斷及治療提供指導意義。
[0009]本發明篩選得到I株小鼠雜交瘤細胞(mus musculus hybridoma) 3G8,已於2014年7月15日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)」，保藏號為CGMCCN0.9457。並對其進行生物學鑑定，以期進一步探討p27的蛋白水平與犬乳腺腫瘤發生、發展的內在聯繫。本發明中的單克隆抗體具有良好的特異性，為其在腫瘤以及其他疾病發生反應中起到相應的作用關係及其功能的深入研究提供依據和奠定基礎，為臨床上相應的治療及預後提供了有效手段。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0010]圖1為犬p27基因片段RT-PCR擴增結果
[0011]圖2為重組犬p27蛋白的SDS-PAGE及純化後的重組蛋白
[0012]圖3為雜交瘤細胞形態
[0013]圖4為雜交瘤細胞株染色體鑑定
[0014]圖5為Western blot分析單克隆抗體特異性實驗結果
[0015]圖6為單克隆抗體的免疫組化分析結果

【具體實施方式】
[0016]實例1ρ27基因的克隆及測序
[0017]根據GenBank中canine p27的cDNA序列(ΝΜ_001002957)，利用引物設計軟體oligo 6.24設計了一組特異性引物，同時在正向引物中引入EcoR I酶切位點，反向引物中引入Sal I酶切位點。正向引物為5-CGGAATTCATGGCAAACGTGCGAGTGTCTAACG-3，反向引物為5-CGGTCGACTTACGTTTGACGTCTTCTGAGGC-3。利用上述弓I物PCR擴增犬p27基因開放閱讀框內位核苷酸，DNA純化試劑盒純化回收PCR產物，使其插入pET28 (a)載體，獲得pET28 (a) -p27重組質粒。將該重組質粒按常規方法轉入感受態細胞DH5ci，酶切法鑑定陽性克隆，陽性克隆送往測序公司測序。上述所採用的PCR擴增，EcoR和Sal I雙酶切，DNA回收，連接於轉化等均為現有技術。
[0018]實例2免疫原的製備
[0019]分別將構建的重組質粒轉化至感受態細胞BL21(DE3)中，塗於Kan_抗性的固體LB平板上，37°C過夜培養。挑取陽性克隆接種於Kan-抗性的液體LB培養液中，37 (°C、250r/min搖床震蕩過夜培養。將過夜活化的陽性克隆按照1: 100的比例接種於Kan-抗性的液體LB培養液中，搖床37°C，250r/min震蕩培養至OD值達0.6左右時，加入ImM IPTG，置搖床中250r/min震蕩，37°C培養，之後9000rpm離心收集菌體，棄掉上清並用PBS洗三次。按照原培養液1/100的比例，用PBS重懸菌體沉澱並進行超聲破碎，4°C下12000g離心30min後，收集上清液。按照Novagen說明書方法將上清通過N1-NTA樹脂進行重組蛋白純化後_70°C保存。
[0020]實例3動物免疫程序
[0021]將純化的His_p27蛋白按100 μ g/只的劑量與等量法國206VG白油佐劑混合，皮下途徑接種6周齡雌性BALB/c小鼠，兩周後肌肉途徑第二次免疫，再經兩周腹腔途徑第三次免疫。兩周後斷尾採血，western blot檢測血清(I: 1000)效價,對效價達到1: 1000以上的小鼠，經腹腔內注射加強免疫無佐劑等量抗原，3日後取小鼠脾細胞進行融合。
[0022]實例4雜交瘤細胞株的建立
[0023]I飼養層細胞的製備
[0024]I)細胞融合前一天進行飼養層細胞的製備，取I只清潔級雌性BALB/c小鼠摘除眼球放血處死。於75%酒精中浸泡5min，以下操作均在超淨工作檯中進行。
[0025]2)將小鼠腹部向上放置於平皿中，用鑷子輕輕提起腹正中部皮膚，用眼科剪刀橫向剪一小切口，切勿剪破腹膜，撕開腹部皮膚，使腹膜充分暴露。用鑷子輕輕提起腹膜，用1mL無菌注射器吸取HAT完全培養液輕輕注入腹腔，注意切勿刺破臟器或腸道造成汙染，輕輕按摩腹部兩側30秒左右，用注射器緩慢抽吸腹腔內微黃色液體，重複以上操作I次。抽吸時注意避開腸繫膜及脂肪組織，以免堵塞注射器。
[0026]3)將取出的腹腔細胞加入到50mLHAT培養液中，充分吹散混勻後，分裝於5塊96孔培養板中，100 μ L/孔。置於37°C、5% CO2培養箱中培養。
[0027]2骨髓瘤細胞的準備
[0028]I)融合前I?2d，擴大培養骨髓瘤細胞，使其處於對數生長期，且生長狀態良好。
[0029]2)融合當天，棄去培養液，並用無血清DMEM輕輕衝洗兩次，用15mL DMEM基礎培養液將細胞從瓶壁上輕輕吹下。取少量骨髓瘤細胞懸液，用細胞計數板計數，準備融合。
[0030]3免疫脾細胞的準備
[0031]I)融合前，將加強免疫的小鼠眼球採血處死，製備陽性血清。浸泡於75%酒精5min後放於超淨工作檯。
[0032]2)將小鼠固定於鼠架上，無菌打開腹腔，分離結締組織取出脾臟，將脾臟放入盛有15mLDMEM基礎培養液的平皿中，用無菌注射器吸取培養液輕輕吹出脾細胞，反覆操作3?4次。
[0033]3)將脾細胞懸液轉入50mL離心管中，加DMEM基礎培養液約至30mL，混勻。對細胞懸液用細胞計數板計數，備用。
[0034]4脾細胞與骨髓瘤細胞融合
[0035]DHAT培養液，DMEM基礎培養液及ImL 50% PEG於37°C水浴中預熱，另備42°C預熱的滅菌水500mL。
[0036]2)上述準備的對數生長期SP2/0細胞與免疫小鼠脾細胞按1: 5，加入50mL離心管中，輕輕顛倒混勻。26°C，100rpm離心1min,棄上清，重複洗滌一次(非常關鍵)，灃意管中DMEM要徹底倒乾淨。用手掌輕擊離心管底部，使底部細胞鬆散均勻呈糊狀。
[0037]3)融合過程在盛有42°C水的融合杯中進行，將ImL 37°C預熱的PEG溶液逐滴加入到50mL離心管中，邊加邊緩慢轉動離心管，並於Imin內加完，靜置I?2min。
[0038]4)先慢後快地加入DMEM基礎培養液終止反應，第Imin滴加ImL DMEM，第2min滴力口 lmLDMEM，第 3min 滴加 3mL DMEM，第 4min 滴加 1mL DMEM，第 5min 滴加 1mL DMEM0 靜置2min。輕輕顛倒2次,靜置7min。800rpm離心1min,棄去上清。用55mL HAT培養液輕輕重懸細胞，100 μ L/孔接種於已培養有飼養細胞的96孔培養板中，置37°C 5%的CO2培養箱中培養。
[0039]5) 5d後半量換液，8d後半量換液，待細胞長至孔底面積1/4?1/3時取上清進行篩選檢測並更換為HT培養液。
[0040]5雜交瘤細胞的篩選
[0041]應用間接ELISA方法檢測雜交瘤細胞培養上清，篩選雜交瘤細胞克隆，將陽性克隆擴大培養，並及時進行細胞凍存與克隆純化。
[0042]實例5單克隆抗體的鑑定
[0043]將雜交瘤細胞培養上清進行系列稀釋，用間接ELISA法測定抗體效價。同時設定陰性、陽性對照。P/N比值大於2.1的MAb最大稀釋度為其ELISA效價。
[0044]應用SBA Clonotyping? System/HRP 抗體亞類鑑定試劑盒(Southern B1tech 公司)鑑定單克隆抗體的亞類。具體方法:取已包被的間接ELISA板，以雜交瘤細胞上清為一抗，以 1: 2500 倍稀釋的 HRP 標記的羊抗鼠 IgA, IgM, IgGU IgG2a、IgG2b、IgG3、κ、λ 為二抗，TMB室溫避光顯色15min，讀取OD45tol。
[0045]雜交瘤細胞染色體數鑑定:
[0046]1.取105個/mL細胞，加秋水仙素(終濃度0.2 μ g/mL)，繼續培養4h ；
[0047]2.1000r/min離心5min,棄上清,加6?8mL 0.075mol/L KCl,立即用吸管將細胞團吹散打勻，室溫下低滲處理25min ；
[0048]3.1000r/min離心5min,棄上清,沿管內壁加6?8mL新鮮配製的3:1甲醇冰乙酸固定液，立即用吸管將細胞團吹散打勻，靜置固定30min，1000r/min離心5min，棄上清，同法固定I次；
[0049]4.用新鮮配製的1:1甲醇冰乙酸固定液進行第三次固定,20min後，1000r/min離心5min，棄上清，留0.2mL左右的細胞團和上清液；
[0050]5.加適量(約5倍於細胞體積)的1:1甲醇冰乙酸固定液，製成細胞懸液。滴片，自然乾燥，Giemsa染色,鏡檢並計數染色體數目。
[0051]將重組蛋白的SDS-PAGE、轉印、封閉等操作同2.2.5，以雜交瘤細胞培養液為一抗，羊抗鼠HRP-1gG(l: 2000)為二抗，DAB底物顯色液中顯色，觀察結果。
[0052]實例6單克隆抗體免疫組織化學染色鑑定
[0053]1、石蠟切片脫蠟至水。
[0054]2,3% H2O2室溫孵育5-10min，以消除內源性過氧化物酶的活性。
[0055]3、蒸餾水衝洗，PBS浸泡5min X2 (如需抗原修復，可在此步後進行)。
[0056]4、微波抗原修復:將切片浸入抗原修復液中，加熱煮沸5min後，放置5_10min ;重複1-2次。冷卻後PBS洗5minX3次
[0057]5、5%正常山羊血清(5% BSA)封閉，室溫孵育lOmin，傾去血清，勿洗。滴加一抗工作液，37°C孵育l_2h或4°C過夜。
[0058]6、PBS 衝洗，5minX3 次。
[0059]7、滴加適量的生物素標記二抗工作液，37°C孵育10_30min。
[0060]8、PBS 衝洗，5minX3 次。
[0061]9、滴加適量的鹼性磷酸酶或辣根酶標記的鏈黴卵白素工作液，3 7 °C孵育10_30min。
[0062]10、PBS 衝洗，5minX 3 次。
[0063]11、顯色劑顯色3-15min，顯微鏡下控制染色(DAB或NBT/BCIP)
[0064]12、在自來水的充分衝洗後，蘇木精輕度復染，脫水，透明，封片。
[0065]13、觀察結果。
【權利要求】
1.一株分泌犬p27單克隆抗體的雜交瘤細胞株，命名為3G8，該雜交瘤細胞株已於2014年7月15日保藏於「中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(簡稱CGMCC)」，保藏號為 CGMCCN0.9457。
2.一種如權利要求1所述的雜交瘤細胞株分泌的犬P27單克隆抗體。
3.—種如權利要求2所述的單克隆抗體在檢測犬乳腺腫瘤組織樣品中p27蛋白的應用。
【文檔編號】C12N5/20GK104328088SQ201410582165
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年10月15日 優先權日:2014年10月15日
【發明者】劉雲, 楊超, 包軍, 姚薇, 李超斯, 童津津, 李情 申請人:東北農業大學