喜樹內生真菌的抗植物病原菌發酵液的製備方法
2023-05-04 15:16:46
專利名稱：喜樹內生真菌的抗植物病原菌發酵液的製備方法
技術領域：
本發明屬於微生物技術領域，涉及一種發酵培養方法，具體涉及喜樹內生真菌的抗菌發酵液的製備方法。
背景技術：
在化學農藥大量使用的今天，帶來了諸多弊端，如環境汙染日益嚴峻、病害蟲抗性顯著提高、人畜安全受到威脅等，由此產生的生態問題層出不窮，且目前公眾對保障食品安全的呼聲越來越高。因此開發安全高效綠色環保的新型農藥迫在眉睫。微生物農藥由於發酵工藝簡單、成本相對低廉、不易使病蟲害產生抗性、對人畜和環境溫和而成為開發新型生物農藥中的熱點。而作為微生物之一的植物內生真菌(Endophytic fungi)在開發新型農藥方面具有極為廣闊的前景而備受矚目。所謂植物內生真菌(Endophytic fungi)是指與宿主植物具有協同進化作用且與宿主植物已經形成互惠共生關係的一類真菌。植物內生真菌(Endophytic fungi)與宿主植物的互惠共生關係表現為:宿主植物產生的光合產物可為內生真菌提供營養；內生真菌產生的代謝產物可以刺激宿主植物的生長發育，同時可以提高植物的抗逆性。因此，植物內生真菌的代謝產物為發現新化合物、篩選新藥物等，提供豐富的原料和廣闊的空間，因此植物內生真菌已成為多領域多學科的研究熱點。尊餓{Camptothecaac應ZaaieO為拱桐科喜樹屬 iPamptotheca)，在我國分布較多，是中國特有樹種。喜樹因從體內提取出具有抗癌的生物鹼和抗逆轉錄病毒而備受關注；在有關喜樹內生真菌的報導也已見諸報端，但主要集中在生物鹼和內生真菌對抗癌和抗逆轉錄病毒和抗菌活性的研究。目前的研究表明在喜樹中存在具有較強的抗植物病原菌活性的內生真菌。因此，研究喜樹內生真菌對新時期農藥的的研發和使用具有理論和實際上的參考價值。
發明內容
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本發明的目的在於提供一種具有較強的抑制植物病原真菌活性的喜樹內生真菌抗植物病原菌發酵液的製備方法。本發明所述的喜樹內生真菌命名為球毛殼(Chaetomium globosum ),保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址:北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2013年3月08日，保藏編號為CGMCC N0.7291。本發明所述的喜樹內生真菌系從中國安徽省安徽農業大學校園內的喜樹iCamptotheca acuminate、植物活體中分離得到的。本發明喜樹內生真菌抗植物病原菌發酵液的具體發酵製備操作步驟如下:
(1)菌種活化
在無菌條件下，將喜樹內生真菌G4的菌種，轉接於已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，置培養箱內溫度28°C ± I °C，恆溫培養7天，得到活化菌種；
(2)發酵培養用無菌打孔器，將活化菌種打成直徑為6mm菌碟，接種3塊菌碟於含有IOOml液體培養基的250ml三角搖瓶內，恆溫搖床培養，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ± 1°C，培養7天，得到喜樹內生真菌G4發酵液；過濾除去菌絲體，過0.22微米過濾器，即得到喜樹內生真菌G4的抗植物病原菌發酵液；
發酵培養特徵:培養第I天，菌體為少量白色的細絲和菌絲球，菌絲球體積較小；培養第3天，出現大量白色的小菌絲球；培養第5天，白色菌絲球繼續增多，並且體積變大；培養第7天，出現大量白色的菌絲球，體積也變大；
所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基:馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蒸餾水I
升;
所述液體培養基:麥芽浸粉25g、蒸餾水I升，pH自然。本發明通過對球毛殼菌G4的發酵產物的抗菌試驗發現，該菌對蘋果腐爛植物病原真菌(fytospora mandshurica)等具有較為明顯的抑制菌絲生長作用。本發明利用植物內生真菌資源，以求獲得抗植物病原真菌病害的新型農用抗生素。本發明所述喜樹內生真菌抗植物病原菌發酵產物的抗菌試驗如下:
1.植物病原真菌:
蘋果腐爛病菌 ifytospora afltfeAtfrica)，葡萄灰黴病菌cinerea ),
褐紋病菌 iPhomopsis vexans ),率炭疽病菌{Gloelsporium fruc tigenum)，梨黑星病菌{Venturia，番爺才古萎病菌{Fusarium oxysporum f.sp.Lycopersici)；
2.病原微生物的培養
用接種環挑取少量病原菌的斜面培養物分別接入馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板活化，在(28± I) °C恆溫箱中培養5天；
3.G4菌發酵液對病原菌菌絲生長抑制測定
在無菌條件下，取喜樹內生真菌G4的抗植物病原菌發酵液10毫升，和滅過菌的處於融化狀態的90毫升的馬鈴薯葡萄糖瓊脂，按照1:9的比例混合均勻，分別各取15毫升倒在直徑為9釐米無菌培養皿內製成平板，冷卻後在每個培養基平面放入I個供試病原菌菌餅(直徑為6毫米)，菌餅的菌絲面貼在培養基表面，將平板置於28±1°C培養72小時。採用十字交叉法測定菌落生長直徑，用下述公式計算抑制率:
權利要求
1.喜樹內生真菌的抗植物病原菌發酵液的製備方法，其特徵在於所述喜樹內生真菌為喜樹內生真菌G4，喜樹內生真菌G4命名為球毛殼菌G4 (.Chaetomium globosum G4)，保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，地址北京市朝陽區北辰西路I號院3號，保藏日期2013年3月8日，保藏編號為CGMCC No. 7291 ； 具體發酵製備操作步驟如下 (1)菌種活化 在無菌條件下，將喜樹內生真菌G4的菌種，轉接於已滅菌的馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基平板中，置培養箱內溫度28°C ± I °C，恆溫培養7天，得到活化菌種； (2)發酵培養 用無菌打孔器，將活化菌種打成直徑為6mm菌碟，接種3塊菌碟於含有IOOml液體培養基的250ml三角搖瓶內，恆溫搖床培養，搖床轉速160轉/分，溫度28°C ± 1°C，培養7天，得到喜樹內生真菌G4發酵液；過濾除去菌絲體，過O. 22微米過濾器，即得到喜樹內生真菌G4的抗植物病原菌發酵液； 發酵培養特徵培養第I天，菌體為少量白色的細絲和菌絲球，菌絲球體積較小；培養第3天，出現大量白色的小菌絲球；培養第5天，白色菌絲球繼續增多，並且體積變大；培養第7天，出現大量白色的菌絲球，體積也變大； 所述馬鈴薯葡萄糖瓊脂固體培養基馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、蒸餾水I升; 所述液體培養基麥芽浸粉25g、蒸餾水I升，pH自然。
全文摘要
本發明涉及喜樹內生真菌的抗植物病原菌發酵液的製備方法。所述喜樹內生真菌命名為球毛殼G4，保藏在中國典型培養物保藏中心，保藏日期2013年3月8日，保藏編號為CGMCC No.7291；該方法包括以下操作步驟1.菌株活化，2.發酵培養，得到喜樹內生真菌G4發酵液，發酵液為黑色；喜樹內生真菌G4發酵液在無菌條件下過濾除去菌絲體，過0.22微米過濾器，即得到喜樹內生真菌G4的抗植物病原菌發酵液。本發明明確了具有抗菌活性的球毛殼菌G4菌株的抗菌發酵液的製備方法，通過對球毛殼菌G4發酵液的抗菌試驗，發現該菌發酵液對蘋果腐爛病菌等植物病原菌具有較為顯著的抑制菌絲生長作用。
文檔編號A01P3/00GK103255065SQ201310138658
公開日2013年8月21日 申請日期2013年4月22日 優先權日2013年4月22日
發明者花日茂, 曾現銀, 柏鈺, 徐慶慶, 操海群, 吳祥為 申請人:安徽農業大學