一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法

2023-05-13 20:01:51 2

專利名稱：一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法
技術領域：
本發明涉及生物活性物質的分離純化方法，尤其涉及一種從鵝血中分離免疫球蛋 白IgY(AFc)的方法。
背景技術：
我國是鴨鵝等水禽飼養的主要國家，年飼養總量達到43億隻，佔世界總量的75% 以上。水禽血液是食品加工過程的下腳料，部分加工成熟血塊食用，大部分被當廢料直接排 到自然界中，不僅浪費了寶貴的生物資源，而且對環境造成了一定的汙染。動物血液是重要 的蛋白質和礦物質來源，目前我國已部分利用了豬血、牛血等畜血資源製備血粉、提取蛋白 及其他生物活性成分，而水禽血液尚未得到充分利用。鵝血是一種高蛋白資源，蛋白含量高 達19%，含有大量球蛋白，具有增強機體免疫力、抗癌等多種功能，已經越來越引起人們的 關注。鵝血中免疫球蛋白包括IgM、IgA和υ -鏈免疫球蛋白。υ -鏈免疫球蛋白在鵝體 液中以IgY和IgY(AFc)兩種形式存在，是鵝抗感染免疫的最主要抗體。IgY的分子量為 180kDa,由兩條重鏈(67kDa)和兩條輕鏈(23kDa)組成，重鏈包括一個可變區和四個恆定區 (CHl 4)，沒有鉸鏈區。IgY(AFc)的分子量為130kDa，也由兩條重鏈和兩條輕鏈組成，輕 鏈與IgY相同，但重鏈分子量僅37 42kDa，與IgY重鏈相比缺失了兩個末端恆定區(CH3 和CH4)。由於IgY(AFc)分子結構的特殊性，免疫原性較低，具有很高的開發利用價值。經 文獻檢索發現，邱翔等(西南民族大學學報，2004，30 (3) 331-333)採用辛酸-硫酸銨沉澱 法、硫酸銨沉澱和DEAE纖維素層析法從鴨血漿中提取IgY，並進行了比較，發現辛酸_硫酸 銨法簡便、快速，所獲得的IgY純度較高，但未報導具體數值。卜春文(食品科技，2004，(5) 79-81,85)從鵝血中提取IgY，收率達85%以上。以上兩篇文獻均未有效分離IgY( Δ Fe)。 日本專利(專利號JP2002030100A，
公開日2002. 1.29)採用免疫親和法從家禽的卵黃中提 取IgY ( Δ Fe)。因此，關於從鵝血等水禽血液中分離純化得到高純度的IgY (AFc),未見有 文獻報導。鵝血中脂肪含量高，通過降低溫度和靜置，去除分層的脂肪，並結合二氧化矽吸 附，可以有效去除血液中的脂肪。辛酸沉澱法是免疫球蛋白蛋白質分離的有效方法，且辛 酸用量少，去除容易。混合模式吸附層析是近年來發展起來的新型層析技術，其功能配基 同時兼有疏水基團和離子交換基團，配基密度通常比較高，吸附容量大，可以通過靜電相吸 來強化吸附或靜電排斥來協助解吸，特別適合於大規模的分離純化。本發明將混合模式吸 附層析與辛酸沉澱兩種分離方法有效結合，用混合模式吸附劑直接處理辛酸沉澱的上清 液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量、高抗體選擇性的特性，建立起一種從鵝血中分離 IgY ( δ Fe)免疫球蛋的經濟高效方法，可以推廣應用到其它水禽血液的處理。

發明內容
本發明的目的是克服現有技術的不足，提供一種從鵝血中分離免疫球蛋白
3IgY(AFc)的方法。從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法包括如下步驟1)配置0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮鵝血與抗凝劑按照體積比為 9 1的比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉速離心10 20分鐘，得到血漿，4 8°C靜置5 12小時，吸除上層聚集的脂肪，加入二氧化矽粉末進一步脫脂，二氧化矽粉末 的加入量為300 1000mg/ml血漿，室溫攪拌30 60分鐘，過濾，得到脫脂血漿；2)將脫脂血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4 5)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 100μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置2 4小時，用離心機以8000-10000rpm轉速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)調節免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m濾膜過濾後， 上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩衝液衝洗，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰 對應的洗脫緩衝液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)將免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固體產品。所述的混合模式吸附劑為MEP Hypercel，或者以4_巰乙基吡啶或2_巰甲基咪唑 為功能配基的層析介質。所述的平衡緩衝液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液，PH值為 5 7。所述的洗脫緩衝液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，pH值為3 4. 5。本發明針對鵝血等水禽血液資源的綜合開發，通過辛酸沉澱與混合模式吸附層析 的有機結合，用於鵝血中免疫球蛋白IgY(AFc)的分離純化。採用混合模式吸附劑直接處 理辛酸沉澱後的上清液，充分利用混合模式吸附的高吸附容量和高抗體選擇性，提高分離 效率，簡化分離步驟，得到一個經濟高效的提取免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。本發明的優 點在於1)快速，成本低廉；2)工藝簡單，易於放大；3)過程處理量大，分離效率高；4)免疫 球蛋白IgY(AFc)的純度高。


附圖是本發明混合模式吸附層析分離鵝血漿免疫球蛋白的電泳譜圖。
具體實施例方式本發明提供一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法。將新鮮抗凝血液離 心去除紅細胞，經過脫脂處理，得到脫脂血漿；用辛酸法沉澱去除部分雜蛋白，得到上清液； 將上清液通過混合模式吸附層析柱進行分離，得到免疫球蛋白IgY(AFc)。通過本發明分離 得到的免疫球蛋白IgY(AFc)純度大於95%。從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法 包括如下步驟1)配置0. IM的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮鵝血與抗凝劑按照體積比為 9 1的比例混合均勻，用離心機以2500 3000rpm轉速離心10 20分鐘，得到血漿，4 8°C靜置5 12小時，吸除上層聚集的脂肪，加入二氧化矽粉末進一步脫脂，二氧化矽粉末 的加入量為300 1000mg/ml血漿，室溫攪拌30 60分鐘，過濾，得到脫脂血漿；2)將脫脂血漿與濃度為60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4 5)按照體積比為1 4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30 100μ 1/ml稀釋血漿，4 8°C靜 置2 4小時，用離心機以8000-10000rpm轉速離心20 30分鐘，取上清液，得到免疫球 蛋白IgY(AFc)粗品溶液；3)調節免疫球蛋白IgY(AFc)粗品溶液的pH至5 7，用0. 45 μ m濾膜過濾後， 上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩衝液衝洗，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰 對應的洗脫緩衝液，得到免疫球蛋白IgY(AFc)溶液；4)將免疫球蛋白IgY(AFc)溶液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度> 95%的免疫球蛋白 IgY(AFc)固體產品。所述的混合模式吸附劑為MEP Hypercel，或者以4_巰乙基吡啶或2_巰甲基咪唑 為功能配基的層析介質。所述的平衡緩衝液為磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀緩衝液，PH值為 5 7。所述的洗脫緩衝液為檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液，pH值為3 4. 5。以下通過實施例對本發明作進一步的描述實施例1取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2500rpm轉速離心20分鐘，除去紅細胞，4°C靜置5小時，除去上層的脂肪，然後按照每 毫升血漿加入二氧化矽300mg，室溫攪拌30分鐘，過濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加 入5ml 60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4)混合均勻，得到稀釋血漿10ml，加入600 μ 1辛酸， 攪拌均勻，4°C靜置2小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液9. 5ml。 上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，調節pH值為7. 0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑1cm) 中填充5ml MEP Hypercel混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的磷酸氫二鈉-磷酸二氫鉀 緩衝液(PH7. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH4. 0)，收集洗脫組分，脫鹽， 冷凍乾燥，得到免疫球蛋白IgY ( Δ Fe)，電泳分析純度為96. 8 %。實施例2取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離 心機以3000rpm轉速離心15分鐘，除去紅細胞，8°C靜置12小時，除去上層的脂肪，然後按 照每毫升血漿加入二氧化矽lOOOmg，室溫攪拌60分鐘，過濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血 漿，加入15ml的60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 5)混合均勻，得到稀釋血漿20ml，加入 600 μ 1辛酸，攪拌均勻，4°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到 上清液19. 6ml。上清液用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為5.0，取2ml作為進樣樣品。層 析柱(內徑Icm)中填充5ml MEP Hypercel混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的磷酸氫二 鈉_磷酸二氫鉀緩衝液(PH5. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH3. 0)，收集 洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為97. 2%。實施例3取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，4°C靜置8小時，除去上層的脂肪，然後按照每 毫升血漿加入二氧化矽300mg，室溫攪拌60分鐘，過濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加 入20ml 60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿25ml，加入2500 μ 1 辛酸，攪拌均勻，8°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液 23.8ml。上清液用0.45 μ m濾膜過濾，調節pH值為6.0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內徑1cm)中填充5ml MEP Hypercel混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的磷酸氫二鈉-磷酸 二氫鉀緩衝液(PH6. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH3. 5)，收集洗脫組 分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為95. 6%。實施例4取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以2500rpm轉速離心20分鐘，除去紅細胞，4°C靜置5小時，除去上層的脂肪，然後按照每 毫升血漿加入二氧化矽500mg，室溫攪拌30min，過濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加入 5ml 60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿10ml，加入300 μ 1辛酸， 攪拌均勻，4°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液9. 5ml。 上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，調節pH值為6. 0，取2ml作為進樣樣品。層析柱(內徑1cm) 中填充5ml以MEP Hypercel為功能配基的混合模式介質，平衡緩衝液為20mM的磷酸氫二 鈉_磷酸二氫鉀緩衝液(PH6. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH4. 0)，收集 洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為95. 8%。實施例5取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，4°C靜置10小時，除去上層的脂肪，然後按照 每毫升血漿加入二氧化矽600mg，室溫攪拌30min，過濾得到脫脂血漿。取5ml脫脂血漿，加 入5ml的60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH5. 0)混合均勻，得到稀釋血漿10ml，加入500 μ 1 辛酸，攪拌均勻，8°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以SOOOrpm離心30分鐘，得到上清液 9. 5ml。上清液用0. 45 μ m濾膜過濾，調節pH值為5. 0，取Iml作為進樣樣品。層析柱(內 徑1cm)中填充5ml以4-巰乙基吡啶為功能配基的纖維素介質，平衡緩衝液為20mM的磷酸 氫二鈉_磷酸二氫鉀緩衝液(PH5. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH3. 0)， 收集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為96. 3%。實施例6取新鮮鵝血，按照9 1(體積比)的比例加入0. IM的檸檬酸鈉溶液抗凝，用離心 機以3000rpm轉速離心10分鐘，除去紅細胞，8°C靜置15小時，除去上層的脂肪，然後按照 每毫升血漿加入二氧化矽800mg，室溫攪拌40min，過濾得到脫脂血漿。取5ml血漿，加入 IOml的60mM的乙酸-乙酸鈉緩衝液(pH4. 5)混合均勻，得到稀釋血漿15ml，加入600 μ 1 辛酸，攪拌均勻，8°C靜置4小時，待雜蛋白沉澱完全，以IOOOOrpm離心20分鐘，得到上清液 15.2ml。上清液用0.45-濾膜過濾，調節pH值為7.0，取2ml作為進樣樣品。層析柱(內徑 Icm)中填充5ml以2-巰甲基咪唑為功能配基的纖維素介質，平衡緩衝液為20mM的磷酸氫 二鈉_磷酸二氫鉀緩衝液(PH7. 0)，洗脫液為20mM的檸檬酸-檸檬酸鈉緩衝液(pH4. 5)，收 集洗脫組分，脫鹽，冷凍乾燥，得到免疫球蛋白IgY(AFc)，電泳分析純度為98. 0%。
權利要求
一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法，其特徵在於包括如下步驟1)配置0.1M的檸檬酸鈉溶液作為抗凝劑，將新鮮鵝血與抗凝劑按照體積比為9∶1的比例混合均勻，用離心機以2500～3000rpm轉速離心10～20分鐘，得到血漿，4～8℃靜置5～12小時，吸除上層聚集的脂肪，加入二氧化矽粉末進一步脫脂，二氧化矽粉末的加入量為300～1000mg/ml血漿，室溫攪拌30～60分鐘，過濾，得到脫脂血漿；2)將脫脂血漿與濃度為60mM的乙酸 乙酸鈉緩衝液(pH4～5)按照體積比為1～4混合均勻，得到稀釋血漿，加入辛酸，辛酸加入量為30～100μl/ml稀釋血漿，4～8℃靜置2～4小時，用離心機以8000 10000rpm轉速離心20～30分鐘，取上清液，得到免疫球蛋白IgY(ΔFc)粗品溶液；3)調節免疫球蛋白IgY(ΔFc)粗品溶液的pH至5～7，用0.45μm濾膜過濾後，上樣到填充有混合模式吸附劑的層析柱中，平衡緩衝液衝洗，洗脫緩衝液洗脫，收集洗脫峰對應的洗脫緩衝液，得到免疫球蛋白IgY(ΔFc)溶液；4)將免疫球蛋白IgY(ΔFc)溶液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度＞95％的免疫球蛋白IgY(ΔFc)固體產品。
2.根據權利要求1所述的一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特徵在 於所述的混合模式吸附劑為MEP Hypercel，或者以4-巰乙基吡啶或2-巰甲 基咪唑為功能 配基的層析介質。
3.根據權利要求1所述的一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特徵在 於所述的平衡緩衝液為磷酸氫二鈉_磷酸二氫鉀緩衝液，PH值為5 7。
4.根據權利要求1所述的一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(AFc)的方法，其特徵在 於所述的洗脫緩衝液為檸檬酸_檸檬酸鈉緩衝液，pH值為3 4. 5。全文摘要
本發明公開了一種從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)的方法。具體步驟如下1)製備脫脂血漿，取新鮮血液，離心，除去紅細胞，進行脫脂，得脫脂血漿。2)辛酸沉澱，向血漿中加入辛酸達到一定濃度，沉澱去除雜蛋白，離心分離，取上清液。3)柱層析，用填充有混合模式吸附劑的層析柱分離上清液，收集洗脫峰。4)脫鹽和乾燥，將收集液脫鹽，冷凍乾燥，得到純度大於95％的免疫球蛋白IgY(ΔFc)。本發明所開發方法的特色在於設計了一條新的分離工藝，可以從鵝血中分離免疫球蛋白IgY(ΔFc)，方法的關鍵在於從辛酸沉澱的上清液中直接提取免疫球蛋白IgY(ΔFc)，具有操作步驟簡單，分離純化因子高的優點，可以推廣應用於其它水禽血液的處理。
文檔編號C07K1/22GK101899110SQ20101022868
公開日2010年12月1日 申請日期2010年7月16日 優先權日2010年7月16日
發明者姚善涇, 林東強, 童紅飛 申請人:浙江大學