木黴菌厚垣孢子的生產方法

2023-05-13 11:46:31 4

專利名稱：木黴菌厚垣孢子的生產方法
技術領域：
本發明涉及一種用於防治植物病害的生防真菌_木黴菌(Trichodermaharzianum)厚垣孢子的生產方法，確切的說是一種通過控制營養條件及發酵條件使木黴菌產生厚垣孢子的方法。
背景技術：
隨著越來越多的有毒化學農藥逐漸被限制使用，世界各國都在加大生物農藥的研究開發力度，大力提倡研製、開發對人、畜無毒、對環境無汙染的微生物農藥已成為熱點。木黴菌作為一類有重要生防價值的拮抗性真菌，早在三十年代就已經發現對植物病原真菌有拮抗作用，其作用機制包括產生抗生素、重寄生作用、溶菌作用、競爭作用等。木黴菌強烈的競爭及生存能力在抑制病原菌尤其是土傳病害的過程中起著重要作用，是一種很有開發利用價值的生防菌種。目前國際上已開發註冊的木黴菌產品已有10多個。但大多為分生孢子製劑，如我國山東省民豐實業有限公司生產的木黴菌(Trichoderma sp.)產品特立克，也是由其分生孢子製成的可溼性粉劑。由於各種技術原因，如產品性能不穩定，有效含量低等原因影響了該類產品在市場上的競爭能力外，其主要原因還是目前現有產品大多為木黴菌的分生孢子製劑，在貯藏過程中易受環境因子的影響縮短孢子壽命，導致生物防治活性的下降，施入土壤後不能在作物根部定植形成有效群體，整體防病效果不佳。這在很大程度上制約了木黴菌生物農藥的規模化生產與推廣。

發明內容
本發明的目的是提供一種用於防治植物病害的木黴菌厚垣孢子的生產方法，以克服分生孢子製劑的孢子存活期短，商品貨價期短，以及由其所帶來的防治效果不穩定等問題。
為實現這樣的目的，本發明採用的生防菌是取自於作物根際的木黴菌，將其純化後轉移至試管斜面內作母菌種，在三角瓶內振蕩培養為二級液體菌種，再經生產罐發酵製成厚垣孢子懸浮液。方法中採用控制營養條件、添加形成厚垣孢子促進劑，調節溫度、pH值、接菌量、供氧量及攪拌速度等技術參數控制發酵條件使其產生厚垣孢子。
本發明的方法具體包括如下步驟1.斜面母菌種製備取作物根表土壤5-10克，加無菌水50-100毫升，經振蕩後稀釋1000-10000倍成稀釋液。取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈黴素0.03-0.04克、瓊脂17-20克、水1000毫升，配製成母菌種培養液。將稀釋液與母菌種培養液按0.1-1∶10-15的比例一起倒入培養皿內製成培養基平板，然後在25-28℃下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種。
其中母菌種培養液的製作方法為將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20-30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補足1000毫升，然後加入葡萄糖及孟加拉紅並使之完全溶化後裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈黴素。
其中試管斜面採用常規PDA培養基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)。
2、二級菌種製備取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-25克、水1000毫升，調pH值為6-6.5，配製成二級發酵培養液，然後分裝在250-1000毫升三角瓶中，裝液量為100-500毫升。在121℃下滅菌20-30分鐘，在無菌室內將斜面母菌種轉入搖瓶，搖床轉速為150-170轉/分，發酵溫度28-30℃，發酵時間為3-4天，得到二級菌種。
其中二級發酵培養液的製作方法為將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20-30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補足1000毫升，然後加入葡萄糖或蔗糖並使之完全溶化後，調pH值為6-6.5，3、生產罐發酵所採用的厚垣孢子培養基配方為馬鈴薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1-2克，硫酸鎂0.5-1克，色氨酸2-4克，果糖2-4克，植物油2-4克，自來水1000毫升。將厚垣孢子培養基在121℃下滅菌30-40分鐘，二級菌種接菌量為1-5％，發酵溫度為25-28℃，調pH值為5-6.5，供氧量150-200kpa(千帕斯卡)，攪拌速度為120-150轉/分，發酵時間5-7天，獲得木黴菌厚垣孢子懸浮液。
其中厚垣孢子培養基的製作方法是將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加2-4倍體積的水煮沸20-30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，倒入發酵灌中，裝液量根據發酵罐的大小確定，然後加入葡萄糖或蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、色氨酸、果糖等並使之完全溶化，加水補足至所需用量。
按照本發明所提供的厚垣孢子培養基配方，調節溫度、PH值、接菌量、供氧量等技術參數，通過液體發酵的方法可使95％以上的菌絲形成厚垣孢子。這種獲得的大量的木黴菌厚垣孢子是真菌菌絲細胞膨大，原生質濃縮，細胞壁增厚而形成的圓形休眠孢子，內部儲藏有較多的脂類物質，用以抵抗不良環境，抗逆性、土壤中競爭力和繁殖速度均很強，而且存活時間長，將其接種在滅菌的硅藻土中，在室溫下可保藏3年以上，孢子仍然能夠萌發。
將本發明所得的木黴菌厚垣孢子懸浮液以1∶4-5的比例與硅藻土、輕質碳酸鈣、草炭等載體充分吸附後製成生防製劑，比分生孢子製劑可提高商品貨價期一年以上，施入土壤後可存活數年。將此生防製劑拌土200倍用於防治植物土傳病害，相對防治效果達60-70％，與分生孢子製劑相比對植物土傳病害的防治效果可提高15％以上。
本發明適用於大多數木黴菌株的發酵，方法簡單易行，適合於大規模工廠化生產，市場前景廣闊。
具體實施例方式
以下結合具體的實施例對本發明的技術方案作進一步描述。
實施例11、斜面母菌種製備取作物根表土壤5克，加無菌水50毫升，經振蕩後稀釋1000倍成稀釋液，取0.1毫升稀釋液與10毫升母菌種培養液一起倒入培養皿內製成培養基平板，其中母菌種培養液取馬鈴薯150克、葡萄糖20克、孟加拉紅0.05克、硫酸鏈黴素0.03克、瓊脂17克、水1000毫升，製作方法為將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補足1000毫升，然後加入葡萄糖及孟加拉紅並使之完全溶化後裝入三角瓶滅菌，在121℃下滅菌30分鐘，倒平板前加入硫酸鏈黴素。在25℃下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至由PDA培養基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)製成的試管斜面內作母菌種。
2、二級菌種製備二級發酵所採用的液體發酵培養液配方為馬鈴薯150克、蔗糖20克、水1000毫升，製作方法是將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加1000毫升水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加水補足1000毫升，調pH值為6.5，裝入500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121℃下滅菌30分鐘，在無菌室內將斜面母菌種轉入搖瓶，搖床轉速170轉/分，發酵溫度26℃，發酵時間為4天，得到二級菌種。
3、生產罐發酵所採用的厚垣孢子培養基配方為馬鈴薯150克，葡萄糖15克，磷酸二氫鉀1克，硫酸鎂0.5克，色氨酸2克，果糖4克，植物油2克，自來水1000毫升。製作方法是根據發酵灌的大小確定裝液量，將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加3倍體積的水煮沸20分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，倒入發酵灌中，然後加入葡萄糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、色氨酸、果糖等並使之完全溶化，加水補足至所需用量，調pH值為6，在121℃下滅菌30分鐘，接菌量為3％，發酵溫度為25-26℃，供氧量150kpa，攪拌速度為120轉/分，發酵時間6天。可使95％以上的菌絲形成厚垣孢子。
將所得木黴菌厚垣孢子懸浮液以1∶4的比例與硅藻土吸附後製成生防製劑，200倍拌土防治瓜類枯萎病，相對防治效果達70％以上。
實施例2
1、斜面母菌種製備取作物根表土壤10克，加無菌水100毫升，經振蕩後稀釋10000倍成稀釋液，取1毫升稀釋液與15毫升母菌種培養液一起倒入培養皿內製成培養基平板，其中母菌種培養液取馬鈴薯200克、葡萄糖20克、孟加拉紅0.06克、硫酸鏈黴素0.04克、瓊脂20克、水1000毫升，製作方法為將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加1000毫升水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，加入瓊脂，加水補足1000毫升，然後加入葡萄糖及孟加拉紅並使之完全溶化後裝入三角瓶滅菌，在121℃下30滅菌分鐘，倒平板前加入硫酸鏈黴素。在28℃下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至由PDA培養基(馬鈴薯200克、葡萄糖20克、瓊脂20克、水1000毫升)製成的試管斜面內作母菌種。
2、二級菌種製備二級發酵所採用的液體發酵培養基配方為馬鈴薯200克、葡萄糖15克、水1000毫升，製作方法同斜面母菌種製備。調pH值為6.5，裝入500毫升三角瓶中，裝液量為200毫升，在121℃下滅菌30分鐘，在無菌室內將斜面母菌種轉入搖瓶，搖床轉速150轉/分，發酵溫度28℃，發酵時間為4天，得到二級菌種。
3、生產罐發酵所採用的厚垣孢子培養基配方為馬鈴薯200克，蔗糖20克，磷酸二氫鉀2克，硫酸鎂1克，色氨酸4克，果糖2克，植物油4克，自來水1000毫升。製作方法是根據發酵灌的大小確定裝液量，將馬鈴薯去皮後切成1釐米見方的小塊，加4倍體積的水煮沸30分鐘，用紗布濾去馬鈴薯塊，倒入發酵灌中，然後加入蔗糖、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、色氨酸、果糖等並使之完全溶化，加水補足至所需用量，調pH值為6.5，在121℃下滅菌40分鐘，接菌量為5％，發酵溫度為27-28℃，供氧量200kpa，攪拌速度為150轉/分，發酵時間7天。可使95％以上的菌絲形成厚垣孢子。
將所得木黴菌厚垣孢子懸浮液以1∶5的比例與輕質碳酸鈣充分吸附後製成生防製劑，200倍拌土防治茄子黃萎病等土傳病害，相對防治效果達65％以上。
權利要求
1.一種木黴菌厚垣孢子的生產方法，其特徵在於包括如下具體步驟1)斜面母菌種製備取作物根表土壤5-10克，加無菌水50-100毫升，經振蕩後稀釋1000-10000倍成稀釋液；取馬鈴薯150-200克、葡萄糖15-20克、孟加拉紅0.04-0.07克、硫酸鏈黴素0.03-0.04克、瓊脂17-20克、水1000毫升，配製成菌種培養液；將稀釋液與菌種培養液按0.1-1∶10-15的比例一起倒入培養皿內製成培養基平板，然後在25-28℃下培養48小時，經分離獲得木黴菌菌株，經純化後轉移至試管斜面內作斜面母菌種；2)二級菌種製備取馬鈴薯150-200克、葡萄糖或蔗糖15-25克、水1000毫升，調pH值為6-6.5，配製成二級發酵培養液，分裝在250-1000毫升三角瓶中，裝液量為100-500毫升，在121℃下滅菌20-30分鐘，在無菌室內將斜面母菌種轉入搖瓶，搖床轉速為150-170轉/分，發酵溫度28-30℃，發酵時間為3-4天，得到二級菌種；3)生產罐發酵厚垣孢子培養基配方為馬鈴薯150-200克，葡萄糖或蔗糖15-20克，磷酸二氫鉀1-2克，硫酸鎂0.5-1克，色氨酸2-4克，果糖2-4克，植物油2-4克，自來水1000毫升；將厚垣孢子培養基在121℃下滅菌30-40分鐘，二級菌種接菌量為2-5％，發酵溫度為25-28℃，pH值為5-6.5，供氧量150-200kpa，攪拌速度為120-150轉/分，發酵時間5-7天，獲得木黴菌厚垣孢子懸浮液。
2.按權利要求1方法得到的木黴菌厚垣孢子的應用，其特徵在於將木黴菌厚垣孢子懸浮液以1∶4-5的比例與載體硅藻土、輕質碳酸鈣、草炭充分吸附後製成生防製劑，再拌土200倍用於防治植物土傳病害。
全文摘要
一種木黴菌厚垣孢子的生產方法，利用從作物根表土壤分離獲得的木黴菌，採用控制營養條件、添加形成厚垣孢子促進劑，調節溫度、pH值、接菌量、供氧量及攪拌速度等技術參數控制發酵條件使其產生厚垣孢子，首先將取自作物根際的木黴菌純化後轉移至試管斜面內作母菌種，然後在三角瓶內振蕩培養為液體菌種，再經生產罐發酵製成厚垣孢子懸浮液。本發明所得的厚垣孢子具有壽命長、防效高、耐儲存等優點，其製劑比分生孢子製劑可提高商品貨價期一年以上。
文檔編號A01N63/04GK1594544SQ20041002568
公開日2005年3月16日 申請日期2004年7月1日 優先權日2004年7月1日
發明者陳捷, 莊敬華, 高增貴 申請人:上海交通大學