基於DNA酶嵌合引物的核酸篩查生物傳感器的製作方法
2023-05-13 12:48:16
本發明涉及一種生物物種鑑定方法，根據pcr和dna酶的特性，設計了一種基於dna酶顯色技術的產物識別技術，並依此建立一種快速靈敏的核酸篩查生物傳感器。
背景技術：
隨著生命科學與分析技術的發展，核酸固有的局限性使其檢測面臨著新的挑戰。在生物醫學分析及研究中會遇到靈敏度低和特異性差、待檢測核酸片段較短或者不能直接擴增等問題，因此，發展核酸探針信號放大檢測技術，實現高靈敏、高特異性檢測顯得尤為重要。下面重點介紹核酸探針與信號放大技術相結合的方法，包括聚合酶鏈式(pcr)放大技術、滾環(rca)放大技術、鏈置換(sda)放大技術、雜交鏈反應(hcr)放大技術及dnazyme信號放大等。pcr是近年來應用最廣的分子生物學技術，被廣泛用於分子診斷，靶標檢測，分子克隆等領域。然而，傳統pcr檢測技術主要通過瓊脂糖凝膠電泳檢測，染料檢測等方式，不僅需要專業的儀器設備，而且費時費力。pcr複雜的產物識別方法嚴重妨礙了其應用於快速檢測領域。隨著功能核酸的發展，許多功能核酸因其獨特的結構及其具有的物理化學特性被應用到分子生物學研究中。近年來，功能核酸被用於構建生物傳感器，從而開發出多種針對dna/rna，重金屬，生物毒素等靶標的快速、高效、靈敏的檢測技術。
脫氧核酶(dnazyme)是通過指數富集配體的系統進化技術由體外篩選分離得到的核酸序列，具有剪切rna分子或dna分子、t4聚核苷酸激酶樣活性、dna連接酶樣活性、催化活性等多種生物催化功能。它具有很高的化學穩定性、造價低廉、容易合成和修飾的優點。dnazyme已經廣泛應用於催化一系列化學和生物反應中。g-四聚體是催化dnazyme一種。g-四聚體可以和陽離子卟啉如cu(ii)卟啉、zn(ii)卟啉、fe(iii)卟啉等作用，使離子卟啉和鳥嘌呤配位結合。g-四聚體可以作為載體和tmpyp4結合，通過高親和力核酸適體的靶向識別作用，定向運載到細胞表面，利用在其光照下產生單線態氧，實現對癌細胞的治療；g-四聚體也可以與血晶素hemin結合，形成g-四聚體/血晶素的複合結構，這種結構具有類似過氧化物酶的催化活性，可以催化過氧化氫h2o2氧化，從而使abts生成有色產物abts.-，在顏色上呈現無色到綠色的變化，能夠快速判斷信號放大效果。
技術實現要素：
本發明目的是開發一種基於pcr放大技術和dnazyme顯色技術的生物傳感器，達到高通量篩查分子靶標的目標。
本發明通過設計含有dnazyme序列的通用引物，一次性擴增多個靶標。利用擴增產物中的dnazyme結構進行核酸比色檢測。整個技術操作簡便，不依賴昂貴儀器且對操作人員要求低，方法準確無汙染，能夠有效快速的篩選出核酸分子，可實現對待測樣品中的現場快速檢測。
為了實現本發明目的，本發明首先提供一種dna酶(即脫氧核酶，dnazyme)，其序列為5』-agggttgggcgggatggg3』(即seqid:no.1)。
本發明上述dna酶也可作為通用引物(ue-universalprimer)用於多重pcr反應體系或檢測轉基因成分。
進一步地，本發明還提供用於檢測(是否含有)轉基因成分的引物組，包括以下任一組引物或幾組引物，還包括上述dna酶(即脫氧核酶，dnazyme，即seqid:no.1；作為通用引物)：
第一組引物：
第二組引物：
第三組引物：
本發明還包括含有上述引物組(seqidno:1-7)的檢測裝置，所述檢測裝置包括核酸篩查試劑盒、核酸生物篩查傳感器。
本發明核酸生物篩查傳感器的設計思路是：首先將dnazyme序列的互補序列嵌合到pcr特異引物中，dnazyme序列作為通用引物(ue-universalprimer)序列添加到反應中。pcr擴增過程中，通用引物中的dnazyme序列形成雙鏈dna片段。由於雙鏈dnazyme序列無法完成顯色反應檢測，含有靶標序列的反應體系沒有顏色變化。而陰性反應因為含有大量的單鏈dnazyme序列，因此能夠實現較強的比色反應，反應體系由無色變為綠色，從而區分出陽性擴增樣品。
進一步地，為了達到良好的顯色效果，上述核酸篩查生物傳感器或核酸篩查試劑盒，還含有將所述dnazyme的3』端刪除3個鹼基的引物，其核苷酸序列為：5』-agggttgggcgggat3』(即seqid:no.8)。
優選地，所述將dnazyme的3』端刪除3個鹼基的引物(即seqid:no.8)與dnazyme的比例為(1:1)-(5:1)，更優選為1:1(0.2:0.2μm)。
本發明還包括上述引物組(seqidno:1-7)、檢測裝置(核酸篩查試劑盒或核酸篩查生物傳感器)在檢測(是否含有)轉基因成分中的應用。
本發明還提供一種基於多重pcr和dnazyme比色技術篩查轉基因成分的方法，包括：
1)待測樣品提取dna；
2)以提取dna為模板，以上述引物組中的任一組引物或幾組引物(seqidno:2-7)為特異引物，以上述引物組中的dnazyme作為通用引物或者以上述dnazyme與所述將dnazyme的3』端刪除3個鹼基的引物(即seqid:no.8)的混合物為通用引物，進行pcr擴增；
優選地，所述將dnazyme的3』端刪除3個鹼基的引物(即seqid:no.8)與dnazyme的比例為(1:1)-(5:1)，更優選為1:1(0.2μm:0.2μm)；
3)結果判斷：反應體系沒有顏色變化的為含有轉基因；反應體系由無色變為綠色的為不含轉基因。
進一步地，所述pcr反應體系如下表所示：
進一步地，所述待測樣品含有p35s，tnos或epsps基因。
本發明具有以下優點：
1、首次將dnazyme應用在多重pcr反應體系中。
2、本傳感器的結果判讀程序簡單快速，適合現場快速診斷。
3、本傳感器具有良好的特異性，能夠對市售食品的進行有效的核酸診斷分析。
4、本傳感器具有良好的靈敏度，檢測限為1％。
5、本傳感器能夠對樣品進行樣品的高通量篩查檢測，可以一次快速檢測多個靶標。
附圖說明
圖1表示實施例1中生物傳感器設計原理。
圖2表示實施例1中生物傳感器優化結果。
圖3表示實施例1中生物傳感器靈敏度分析結果。
具體實施方式
以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。若未特別指明，實施例均按照常規實驗條件，如sambrook等分子克隆實驗手冊(sambrookj&russelldw,molecularcloning:alaboratorymanual,2001)，或按照製造廠商說明書建議的條件。
實施例中未註明具體技術或條件者，按照本領域內的文獻所描述的技術或條件，或者按照產品說明書進行。所用試劑或儀器未註明生產廠商者，均為可通過正規渠道商購買得到的常規產品。
以下所用pcr反應體系：
實施例1
1、實驗材料：實驗中所用到的靶標為轉基因作物，分別為mon87460，mon810，mon87701，mon87705，gt73，mon888302，h7-1，mon89788，j101andtt51-1，均有實驗室保存。多重pcr核酸篩查試劑盒購自大連寶生物公司。磷酸緩衝液(10mm磷酸二氫鉀，100mm氯化鉀，2mm氯化鎂，0.003％(v)tritonx-100，ph＝7.0)。儲存緩衝液(1.843g磷酸氫二鈉，0.933g檸檬酸，100ml，ph4.0)。
2、基因組提取：按照植物基因組dna提取核酸篩查試劑盒(天根，北京)進行提取，說明書如下：
(1)取植物乾重組織約30mg，加入液氮充分碾磨。
(2)將研磨好的粉末迅速轉移到預先裝有700μl65℃預熱緩衝液gp1的離心管中(實驗前在預熱的gp1中加入巰基乙醇，使其終濃度為0.1％)，迅速顛倒混勻後，將離心管放在65℃水浴20min，水浴過程中顛倒離心管以混合樣品數次。
(3)加入700μl氯仿，充分混勻，12，000rpm離心5min。注:若提取富含多酚或澱粉的植物組織，可在第3步前，用酚:氯仿/1:1進行等體積抽提。
(4)小心地將上一步所得上層水相轉入一個新的離心管中，加入700μl緩衝液gp2，充分混勻。
(5)將混勻的液體轉入吸附柱cb3中，12，000rpm離心30s，棄掉廢液。(吸附柱容積為700μl左右，可分次加入離心。)
(6)向吸附柱cb3中加入500μl緩衝液gd(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。
(7)向吸附柱cb3中加入600μl漂洗液pw(使用前請先檢查是否已加入無水乙醇)，12，000rpm離心30s，倒掉廢液，將吸附柱cb3放入收集管中。
(8)重複操作步驟7。
(9)將吸附柱cb3放回收集管中，12，000rpm離心2min，倒掉廢液。將吸附柱cb3置於室溫放置數分鐘，以徹底晾乾吸附材料中殘餘的漂洗液。
(10)將吸附柱cb3轉入一個乾淨的離心管中，向吸附膜的中間部位懸空滴加50-200μl洗脫緩衝液te，室溫放置2-5min，12，000rpm離心2min，將溶液收集到離心管中。
3、引物設計：
通過primerexpress3.0設計軟體(美國生命技術公司)針對轉基因產品中的篩選基因p35s，tnos和epsps基因設計pcr引物。
定性pcr所用引物
4、傳感器設計
設計思路：核酸篩查傳感器首先將dnazyme序列的互補序列嵌合到pcr特異引物中，dnazyme序列作為通用引物序列添加到反應中。pcr擴增過程中，通用引物中的dnazyme序列形成雙鏈dna片段。由於雙鏈dnazyme序列無法完成顯色反應檢測，含有靶標序列的反應體系沒有顏色變化。而陰性反應因為含有大量的單鏈dnazyme序列，因此能夠實現較強的比色反應，反應體系由無色變為綠色，從而區分出陽性擴增樣品。
如圖1所示，核酸篩查傳感器首先將dnazyme序列的互補序列(圖1a圓圈中長鏈淺色部分)嵌合到pcr特異引物中，dnazyme序列(圖1a圓圈中雜亂短鏈)作為通用引物序列添加到反應中。pcr擴增過程中，通用引物中的dnazyme序列形成雙鏈dna片段。pcr後加入80μl磷酸緩衝液和10μl氯高鐵血紅素(圖1淺色橢圓)，37℃孵育20min，而後加入30μl儲存緩衝液即可肉眼觀察顏色變化效果。由於雙鏈dnazyme序列無法完成顯色反應檢測，含有靶標序列的反應體系沒有顏色變化。而陰性反應因為含有大量的單鏈dnazyme序列，因此能夠實現較強的比色反應，反應體系由無色變為綠色，從而區分出陽性擴增樣品。
5、反應體系優化：為了達到良好的顯色效果，本發明設計了不同dnazyme序列長度的通用引物以及通用引物的混合比例。通過優化發現，3』端刪除3個鹼基的通用引物和原始通用引物混合且混合比例在在(1:1)-(5:1)為佳，尤以1:1(0.2μm:0.2μm)時效果最好。優化後的傳感器能夠實現分子靶標的肉眼識別。結果見圖2；其中，圖a1和圖a2表示不同通用引物和混合比例的比色值(淺色為優化結果，深色為對應陰性比色結果)；圖b表示不同通用引物的比色情況；圖c表示不同引物混合比例的比色情況(與圖a2相對應)。
6、傳感器特異性分析
利用實驗室保存的轉基因樣品和市售食品進行傳感器的特異性分析。通過實驗室保存的轉基因樣品和超市購買的食品的檢測，充分體現了本傳感器的特異性。通過邏輯門的運算可以最終判斷出樣品中是否含有轉基因成分，從而完成多靶標的高通量篩查效果。本發明選取的p35s，tnos和epsps能夠覆蓋90％商業化的轉基因作物，因此能夠有效地篩查市場中的轉基因成分。結果見下表。
傳感器特異性分析
7、傳感器靈敏度分析
為了評定傳感器的靈敏性，將轉基因樣品mon87460和mon88302的基因組dna濃度稀釋成6個梯度，100％，50％20％，10％，1％和0.1％，進行通用引物多重pcr和dnazyme比色研究。結果顯示，本傳感器可以檢測最低1％含量的轉基因樣品，即180個拷貝數。雖然本傳感器的靈敏度沒有很大的提高，但是其對於樣品的初篩和質量控制依然有很大的應用價值。結果見圖3。
雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。
序列表
中國農業大學
基於dna酶嵌合引物的核酸篩查生物傳感器
khp171113743.8
8
patentinversion3.3
1
18
dna
人工序列
1
agggttgggcgggatggg18
2
41
dna
人工序列
2
tcccaacccgccctaccccatcattgcgataaaggaaaggc41
3
39
dna
人工序列
3
tcccaacccgccctaccctgctttgaagacgtggttgga39
4
38
dna
人工序列
4
tcccaacccgccctacccgaatcctgttgccggtcttg38
5
38
dna
人工序列
5
tcccaacccgccctacccttatcctagtttgcgcgcta38
6
40
dna
人工序列
6
tcccaacccgccctacccacggtgaccgtcttccagttac40
7
39
dna
人工序列
7
tcccaacccgccctacccgaacaagcaaggcagcaacca39
8
15
dna
人工序列
8
agggttgggcgggat15