HULCsiRNA及其在製備治療肝癌的藥物中的用途的製作方法
2023-04-26 10:19:21 1
專利名稱：HULC siRNA及其在製備治療肝癌的藥物中的用途的製作方法
技術領域：
本發明涉及HULC SiRNA、表達針對HULC的siRNA的表達載體、包含該表達載體的宿主細胞、活性成分為所述針對HULC的siRNA或所述表達載體的組合物。本發明還涉及一種用於治療肝癌的試劑盒，其含有所述針對HULC的siRNA或所述表達載體。本發明還涉及所述針對HULC的siRNA或所述表達載體在製備治療肝癌的藥物中的用途以及HULC作為肝癌的治療靶點的用途。
背景技術：
肝癌是全球範圍內致死率最高的腫瘤之一，而我國又是肝癌的高發國家，每年有超過30萬的病人死於肝癌。作為一個多因素的遺傳性疾病，肝癌的病因非常複雜，目前肝癌診療中存在著早期診斷難、復發轉移率高、創新藥物和治療手段少等問題，因此，對肝癌分子發病機制及肝癌診治新技術、新療法的研究尤為重要和迫切[1]。miRNA是一種小分子的非編碼RNA，它的機制與siRNA類似，與靶mRNA結合後抑制mRNA的翻譯。多個研究發現， 在腫瘤組織中，miRNA的表達譜發生了明顯的變化，它被認為是腫瘤診斷的標誌物以及治療的工具β]。2009年6月《Cell》雜誌報導，美國的Janaiah Kota等人發現將一種在肝癌中低表達的miRNA重新導入小鼠肝癌模型中可以引起腫瘤細胞特異性的凋亡並且無毒性，從而治療腫瘤 ]。這些通過導入非編碼RNA來治療肝癌的研究成果為腫瘤的治療提出了新的方向。非編碼RNA (non-coding RNA，ncRNA)，是指那些由DNA轉錄卻並不翻譯成蛋白的 RNA，主要包括snoRNA，miRNA，siRNA，piRNA以及一些長片段的非編碼RNA等M。這些ncRNA 分子通過不同的機制，如RNA-RNA鹼基配對，RNA蛋白相互作用，RNA-DNA相互作用等，在細胞調控的各個層面中發揮功能，包括參與染色質修飾、轉錄調節、剪切加工、RNA穩定性調節等。近來還有研究發現，在一些腫瘤組織中，ncRNA有著過表達或者低表達的現象。提示在腫瘤的發生發展過程中，它們可能發揮著重要的作用[5』6』7]。細胞增殖、分化以及凋亡的異常導致腫瘤的發生，而ncRNA作為一個重要調控單位，參與調控相關基因的表達，它們的異常表達有可能引起這些現象的發生。隨著越來越多腫瘤特異性ncRNA的發現以及對這些 ncRNA在腫瘤發生發展中分子機制的深入研究，在不遠的將來它們不僅能作為早診、預後的標誌物，甚至可以成為腫瘤治療的靶位點，幫助人類早日戰勝腫瘤。2007年，研究者們在肝癌中發現了一種明顯表達升高的基因，並將它命名為 HULC，即 Highly Up-reglated in Liver Cancer,其在 NCBI 上的基因序列號為 NR_004855. 2。這個基因定位於6pM. 3，含有一個內含子和兩個外顯子，其中內含子長度為 1152bp，兩個外顯子分別為182bp和30;3bp。HULC基因轉錄產物經過剪切和加工後形成一個 500bp的RNA，具有類似於mRNA的polyA尾結構。但通過序列比對，在現在已知的任何物種的蛋白中都不含這種胺基酸序列。用這72個預測的胺基酸製備抗體，在HULC RNA高表達的肝癌組織中檢測，也未能發現目的條帶。同時通過體外翻譯的實驗，也進一步證實了該序列並不編碼蛋白，即HULC是一種長片段的非編碼RNAm。該研究由KatrinPanzitt等人發表在 07 年 Gastroenterology 雜誌上，另夕卜 Matouk 等人在 2009 年的 Eur J Gastroenterol Hepatol雜誌上發表關於HULC RNA不僅在原發的肝癌組織中高表達，並且在結腸癌肝轉移的組織中也檢測到其高表達ω。由於HULC RNA除了在肝癌組織中高表達還能在肝癌病人的血液中檢測到其高表達，所以它可以作為一種潛在的肝癌標誌物應用到診斷中，甚至在不久的將來有可能會應用到肝癌的治療中。但截至目前，現有研究僅證明HULC在肝癌或結腸癌肝轉移的組織高高表達，尚未知曉該高表達是肝癌發展的結果還是肝癌發展的原因。siRNA是一種雙鏈的小分子RNA，一般長度為21-25個核苷酸，在RNAi (RNA幹擾) 途徑中起作用，進來逐漸成為科學家們研究的熱點。《科學》雜誌將其列為2002年10大科技突破之首。這些小片段一旦與信使RNA(mRNA)中的同源序列互補結合，便會導致mRNA失去功能，即不能翻譯產生蛋白質，也就是使基因「沉默」了 [1°]。1998年，美國史丹福大學醫學院的安德魯 法爾等發現了 siRNA，並憑藉這個驚人的發現而獲得了 2006年生理學/醫學獎。2004年，美國生物學家、1993年諾貝爾生理學或醫學獎獲得者菲利普·夏普在《自然》雜誌上撰文指出「RNAi有望成為迄今最有力的實驗室工具。」 siRNA可以通過化學合成、DNA載體導入以及反轉錄病毒載體導入的方法導入細胞中，由於siRNA具有高度的序列專一性而使特定基因沉默，功能喪失，目前，siRNA已經被廣泛的應用到了特定基因的功能研究中。目前siRNA的獲取方式主要有化學合成、siRNA表達載體以及體外轉錄等。其中化學合成的方法具有操作簡便，轉染效率高，對細胞的或者組織的毒副作用小，可大規模製備等優勢。由於siRNA能抑制特定基因的表達，應用siRNA進行基因治療有非常廣闊的臨床應用前景。心臟病、肝炎、癌症和愛滋病等大都是人類基因變異或病毒入侵造成的，應用 siRNA技術可望能關閉某些特殊基因而治癒這些疾病。目前，各大生物技術公司都在積極開發這類藥物，並即將進入臨床試驗階段。原癌基因是細胞基因組中的正常組成成分，當受到多種因素的作用使其發生變異時，激活成為癌基因，癌基因與細胞異常增殖及癌的發生有關。可以應用siRNA技術來抑制癌基因的mRNA，從而抑制腫瘤生長，同時，還可通過siRNA 技術促進癌細胞凋亡、調控細胞周期以及抑制血管生成等方面來治療癌症。儘管RNAi技術作為腫瘤基因治療的新型工具仍然存在著許多急待解決的問題，如怎樣提高腫瘤細胞的靶向性等等。但隨著科學工作者對RNAi研究的不斷深入，siRNA技術將會成為一種非常有前景的腫瘤治療手段。因此，如果能利用RNAi技術，涉及特異性針對HULC的siRNA，徹底研究清楚HULC 和肝癌或結腸癌轉移的組織間的關係，將會為肝癌相關的癌症的治療提供一種有益的途徑。
發明內容
因此，本發明的技術目的在於利用RNAi技術研究清楚HULC與肝癌相關的癌症的關係。因此，本發明的第一方面涉及一種針對HULC的siRNA。本領域技術人員公知針對 HULC的siRNA的獲取方法，優選地，所述獲取方法為全化學合成、重組表達或體外轉錄。優選地，所述的針對HULC的siRNA選自SiRNA :5，-UAAAGGCUCCAAUUCCAUCAUGA⑶-3，(SEQ IDN0. 5)或
SiRNA-B :5，-UUGAAAUGUCCACGAUCAGA⑶UCC-3，(SEQID No. 6)。本發明的第二方面涉及一種表達如上所述的針對HULC的SiRNA的表達載體，優選地，所述表達載體為原核表達載體或真核表達表達載體，更優選地，所述表達載體為真核表達載體，最優選地，所述真核表達載體為腺病毒表達載體。本發明的第三方面涉及一種含有如上所述的表達載體的宿主細胞，優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，更優選地，所述宿主細胞為真核細胞，更優選地，所述宿主細胞為哺乳動物細胞，最優選地，所述細胞為HepG2細胞。本發明的第四方面涉及一種活性成分為如上所述的針對HULC的SiRNA或如上所述的表達載體的組合物。本領域技術人員公知，在製備所述組合物時，考慮到siRNA或表達載體本身的性質以及所要應用的目的，其還可以另外包含抑制RNA降解的試劑、pH調節劑、 賦形劑等藥學上可接受的輔料。本發明的第五方面涉及一種用於治療肝癌的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中含有如上所述的針對HULC的siRNA或如上所述的表達載體。本領域技術人員公知，在製備所述試劑盒時，考慮到siRNA或表達載體本身的性質以及所要應用的目的，其還可以另外包含抑制RNA降解的試劑、pH調節劑、賦形劑等藥學上可接受的輔料。本發明的第六方面涉及如上所述的針對HULC的siRNA或如上所述的表達載體在製備治療肝癌的藥物中的用途。本發明的第七方面涉及一種HULC作為肝癌的治療靶點的用途。優選地，所述治療靶點選自靶序列1 :5，-ACTCATGTAGGAATTGGAGCCTTTA-3，(SEQ IDNo. 7)，或靴序列2 :5，-GGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA-3，(SEQ ID No. 8)。換言之，在本研究中，我們分別針對在肝癌或結腸癌肝轉移的組織中高轉錄的 HULC基因的不同靶位點，委託invitrogen公司化學合成兩段siRNA序列。當然，本領域技術人員公知，針對HULC基因可以設計多種siRNA序列，只要這樣的siRNA序列可以有效的敲除HULCRNA的表達。這樣的siRNA序列也落入本發明的保護範圍。我們的研究發現，通過瞬時轉染這兩種siRNA片段，可以敲除HULC RNA在肝癌細胞系中的內源性RNA高表達， 從而抑制肝癌細胞的增殖、侵襲以及抗凋亡能力。通過轉染我們設計的siRNA序列，可以明顯敲降HULCRNA的表達，並能抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲以及抗凋亡的能力。因此，本發明首次證實HULC RNA表達的敲除與肝癌細胞增殖、侵襲以及抗凋亡的抑制間存在直接對應的關係，HULC完全可以作為肝癌的治療靶點，本發明的siRNA未來也有望作為一種生物治療技術應用到肝癌的治療中。
圖 1 是 RT-PCR 檢測 293T，EC9706，KYSE150，HCT116，SMMC-7721，!fepG2，H446 以及 H1299共8株細胞系中HULC RNA的表達水平，其中條帶深淺代表RNA表達量的高低。HepG2 細胞株中HULC RNA表達水平明顯升高，故選擇其作為敲降HULC RNA的研究對象。圖2是分別轉染兩種siRNA後，HULC RNA的敲降效率，同時用RT-PCR和real-time PCR檢測siRNA的敲降效率，A為RT-PCR驗證，其中條帶深淺代表RNA表達量的高低；B為 real-time PCR驗證，分別以HULC RNA在細胞中的含量除以其細胞中GAPDH表達含量後做成柱狀圖。圖3是轉染HULC RNA siRNA的細胞株以及轉染陰性對照RNA的生長曲線。圖4是克隆形成實驗結果圖，A、B分別為顯微觀察圖和柱狀統計圖。圖5是穿膜實驗結果圖。其中A是穿過膜的細胞照片，B是統計後的做成的柱狀圖。圖6是用不同濃度順鉬處理細胞後，檢測其凋亡率。其中HULCsiRNA轉染的細胞在40 μ M濃度下其凋亡率與陰性對照SiRNA轉染的細胞有明顯差異。
具體實施例方式下面將通過下述非限制性實施例進一步說明本發明，本領域技術人員公知，在不背離本發明精神的情況下，可以對本發明做出許多修改，這樣的修改也落入本發明的範圍。下述實驗方法如無特別說明，均為常規方法，所使用的實驗材料如無特別說明，均可容易地從商業公司獲取。實施例實施例1、HULC RNA高表達細胞系的篩選利用RT-PCR的方法，篩選出HULC RNA高表達細胞系IfepG2 (電泳圖見圖1)。在 293T, EC9706, KYSE150, HCT116, SMMC-7721, HepG2, H446 以及 H1299 共 8 種腫瘤細胞系(均為商業化的細胞系)中，HepG2細胞系HULC的RNA表達量非常高(見圖1)。RT-PCR及所採用的引物如下HULC 上遊引物5，-AACCTCCAGAACTGTGAT-3，(SEQ IDN0. 1)下遊引物5，-CATAATTCAGGGAGAAAG-3，(SEQID NO. 2)產物大小216bpGAPDH 上遊5_GCT GAG AAC GGG AAG CTT GT-3 (SEQ IDNO. 3)下遊5-GCCAGG GGT GCTAAG CAG TT-3 (SEQ IDNo· 4)產物大小299bpRT (逆轉錄)的條件各取 5 μ g 細胞總 RNA 用 Supei^criptTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR Kit 完成 cDNA 第一鏈合成。PCR條件取1 μ 1逆轉錄合成的cDNA第一鏈作為模板，25ulPCR反應體系，退火溫度為陽度，30個循環，擴增目標基因。PCR反應產物10 μ 1上樣於1. 5%瓊脂糖凝膠電泳分析。實施例2、HULC siRNA的敲除效率分別針對該基因不同的靶位點，委託invitrogen公司化學合成下述兩段siRNA序列siRNA-A :5，-UAAAGGCUCCAAUUCCAUCAUGA⑶_3，(SEQID NO. 5)(僅指正義鏈)siRNA-B :5，-UUGAAAUGUCCACGAUCAGA⑶UCC-3，(SEQID No. 6)(僅指正義鏈)。通過用HULC siRNA轉染H印G2細胞系，並利用RT-PCR以及real-time PCR方法驗證其敲降效率。上述siRNA-A和siRNA_B所針對的HULC中的靶點序列分別如下靶序列1 :5，-ACTCATGTAGGAATTGGAGCCTTTA-3，(SEQ IDNo. 7)，或
靴序列2 :5，-GGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA-3，(SEQ IDNo. 8)。轉染條件①將2 μ M siRNA稀釋於500 μ 1無血清RPMI-1640培養基中，輕輕混勻；再取4 μ 1 RNAi MAX (購自invitrogen公司)稀釋於上述500 μ 1RPMI-1640無血清培養基中，混勻，室溫孵育20分鐘。②消化H印G2細胞，將細胞種入上述含有複合物的培養皿中，並使細胞在轉染M 小時後密度在大約30-50%之間。RT-PCR反應以及引物同上。real-time PCR(實時螢光定量PCR)引物同上，反應條件同上。應用ABI 7300thermocycler實時螢光定量PCR儀完成，實驗獲得的數據使用ABI公司的System SDS software軟體進行分析。在siA、siB及siNC(購自invitrogen公司，為通用陰性對照，貨號為12935-300)。 在本實驗中，該序列的轉染不會敲降HULC以及任何其他的基因，從而起到陰性對照的作用。)轉染細胞後，HULC RNA的表達量分別佔作為內標的GAPDH mRNA表達量的 0. 052士0.003%、0. 039士0.001 % 以及 0. 162士0.001%。表明這兩種 siRNA 片段都能夠有效的敲降HULC表達水平，敲降效率分別達到68. 和76. 1% (見圖2，A-B)。實施例3、HULC siRNA對細胞生長速度的影響將H印G2細胞以每孔5 X 103個種入M孔板中，分別轉染對照siNC、siA及siB， 然後在1、2、3、4、5天消化細胞計數(每天平行設置3孔取平均數)。以細胞培養時間為橫坐標，細胞數為縱坐標，繪製細胞生長曲線。結果發現轉染HULC siRNA的細胞系與轉染的陰性對照的細胞株相比，細胞生長速度明顯減慢，生長曲線呈顯著減慢上升趨勢(見圖3)。實施例4、HULC siRNA對細胞株克隆形成能力的影響克隆形成實驗①取生長狀態良好的細胞(約80%融合度)，用胰蛋白酶消化成單個，接種細胞於六孔板(購自corning公司)中，每孔500個，設三個平行皿。②將培養皿置37°C 5% C02培養箱中14天，至克隆形成。③克隆固定和染色倒去培養基，用PBS洗滌兩次，加入70%的甲醇固定，鋪滿培養皿表面，固定10分鐘。棄去固定液，待稍乾燥後(約5分鐘)加入0.5%的結晶紫染色液 (甲醇配製)，染色約20分鐘，在鏡下檢查染色程度，在克隆著色足夠時用水洗去殘餘染液， 以每團細胞數大於50個時作為一個克隆進行計數，並檢查克隆大小。克隆形成試驗表明轉染HULC SiRN的細胞株克隆形成能力明顯低於轉染陰性對照的細胞株(見圖4，A-B)。實施例5、HULC siRNA對細胞株穿透能力的影響穿膜實驗(Transwell)使用corning costar的iTransewll小室檢測細胞的侵襲能力①將Matrigel稀釋至250μ g/ml，包被8μπι聚碳酯膜，37°C 5% C02孵育30分鐘待用。②取生長狀態良好的細胞(約80%融合度)，用胰蛋白酶消化，將200μ1 1X104 個細胞種植於每個iTranswell小室的上層。③將800 μ 1含有纖維連接蛋白(5 μ g/ml)的RPMI1640完全培養基，加入到Transwell小室的下層。④將Transwell小室置於37°C 5% C02培養箱中，培養10小時。⑤用棉籤刮去上室中的細胞。⑥以75%的甲醇固定膜上的細胞，15分鐘，以0.5%結晶紫(甲醇配製)染色20 分鐘，蒸餾水清洗。⑦顯微鏡下計數聚碳酯膜下表面的細胞數，進行統計學分析，同時拍照。Transwel 1檢測表明低表達HULC RNA後細胞株穿透能力明顯低於轉染陰性對照 RNA的細胞株(見圖5，A-B)，說明敲降HULC RNA可抑制腫瘤細胞的惡性度以及腫瘤細胞的轉移能力。實施例6、HULC siRNA對細胞凋亡能力的影響流式細胞儀檢測細胞凋亡胰蛋白酶消化處理培養細胞並重懸，IOOOrpm離心5分鐘，棄上清，用預冷的PBS洗滌細胞三次，加入Iml預冷的10%甲醛，室溫作用10分鐘。離心收集細胞，用PBS洗兩次。 細胞沉澱用Iml預冷的含3%血清和70%乙醇的PBS於_20°C固定過夜，離心收集細胞，用 PBS洗細胞沉澱。加入200 μ 1 RNase A(lmg/ml)，37°C水浴30分鐘。再加入800 μ 1碘化丙啶染色液(50 μ g/ml)，混勻，置4°C避光30分鐘。使用螢光激活細胞分選器(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) (Becton-Dickinson，USA)檢測，記錄激發波長 488nm 處的紅色螢光，每份標本均檢測10000個細胞結果用細胞周期擬合軟體DNAMultiCycle進行分析。細胞凋亡實驗表明，低表達HULC RNA後細胞抵抗順鉬引起的凋亡能力明顯減弱， 特別在高濃度(40 μ M)的條件下，具有統計學意義(見圖6)。參考文獻1. Thorgeirsson, S. and Grisham, W. · Molecular pathogenesis ofhuman hepatocellular carcinoma. Nat Genet,2002,31,339-346.2. Costa Fabri' cio F. Non-coding RNAs :New players in eukaryoticbiology. Gene,2005，357，83-94.3. Janaiah Kota, Raghu Chivukula and Kathryn A. 0' Donne 11, et al. Therapeutic delivery of miR_26a inhibits cancer cell proliferation andinduces tumor-specific apoptosis. Cell,2009,137(6) 1005-1017.4. Hall P. A. , Russell S. H. New perspectives on neoplasia and theRNA world. Hematol Oncol,2005，23(2) :49-53.5. Juan, V.，Crain, C.，and Wilson, C. Evidence for evolutionarilyconserved secondary structure in the H19 tumor suppressor RNA. NucleicAcids Res,2000,28, 1221-1227.6. Watanabe, Μ. , Yanagisawa, J. , Kitagawa, H. , A subfamily ofRNA-binding DEAD-box proteins acts as an estrogen receptor alphacoactivator through the N-terminal activation domain (AF-I)with an RNAcoactivator, SRA. Embo J,2001,20, 1341-1352.7. Wolf,S. ,Mertens,D. ,Schaffner,. et al. . B~cell neoplasia associatedgene
8with multiple splicing(BCMS) :the candidate B-CLL gene on 13ql4comprises more than 560kb covering all critical regions. Hum Mol Genet，2001，10，1275-1285.8. Panzitt, K. , Tschernatsch, Μ. M.，Guelly，et al. Characterization ofHULC, a novel gene with striking up—regulation in hepatocellularcarcinoma,as noncoding RNA. Gastroenterology,2007，132，330-342.9. Matouk，I. J.，Abbasi, I，et al. Highly upregulated in liver cancernoncoding RNA is overexpressed in hepatic colorectal metastasis. Eur JGastroenterol Hepatol,2009,21,688-692.10. Matzke M. , Matzke A. J. , Kooter J. M. RNA :guiding genesilencing[J]. Science.2001,293(5532) :1080_1083。
權利要求
1.一種針對 HULC 的 siRNA。
2.根據權利要求1所述的針對HULC的siRNA，其選自siRNA-A :5，-UAAAGGCUCCAAUUCCAUCAUGA⑶-3，(SEQID NO. 5)或siRNA-B :5』 -UUGAAAUGUCCACGAUCAGA⑶UCC-3，(SEQID No. 6)。
3.根據權利要求1或2所述的針對HULC的siRNA，其特徵在於其採用化學合成、重組表達或體外轉錄方法獲得。
4.一種表達權利要求1或2所述的針對HULC的siRNA的表達載體，優選地，所述表達載體為原核表達載體或真核表達表達載體，更優選地，所述表達載體為真核表達載體，最優選地，所述真核表達載體為腺病毒表達載體。
5.一種含有權利要求4所述的表達載體的宿主細胞，優選地，所述宿主細胞為原核細胞或真核細胞，更優選地，所述宿主細胞為真核細胞，更優選地，所述宿主細胞為哺乳動物細胞，最優選地，所述細胞為H印G2細胞。
6.一種活性成分為如權利要求1或2所述的針對HULC的siRNA或如權利要求4所述的表達載體的組合物。
7.一種用於治療肝癌的試劑盒，其特徵在於所述試劑盒中含有如權利要求1或2所述的針對HULC的siRNA或如權利要求4所述的表達載體。
8.根據權利要求1或2所述的針對HULC的siRNA或如權利要求4所述的表達載體在製備治療肝癌的藥物中的用途。
9.一種HULC作為肝癌的治療靶點的用途。
10.根據權利要求9所述的HULC作為肝癌的治療靶點的用途，其特徵在於所述治療靶點選自靴序列 1 :5，-ACTCATGTAGGAATTGGAGCCTTTA-3，(SEQ IDNo. 7)，或靴序列 2 :5』 -GGAACTCTGATCGTGGACATTTCAA-3』 (SEQ IDNo. 8)。
全文摘要
本發明涉及HULC siRNA及其在製備治療肝癌的藥物中的用途。特別地，本發明涉及針對HULC的siRNA、表達針對HULC的siRNA的表達載體、包含該表達載體的宿主細胞、活性成分為所述針對HULC的siRNA或所述表達載體的組合物。本發明還涉及一種用於治療肝癌的試劑盒，其含有所述針對HULC的siRNA或所述表達載體。本發明還涉及所述針對HULC的siRNA或所述表達載體在製備治療肝癌的藥物中的用途以及HULC作為肝癌的治療靶點的用途。本發明為肝癌的治療提供了一種有前景的作用靶點及一類有治療前景的藥物候選物。
文檔編號C12N1/21GK102453713SQ20101051241
公開日2012年5月16日 申請日期2010年10月20日 優先權日2010年10月20日
發明者付明, 劉雪峰, 宋詠梅, 李丹, 童彤, 詹啟敏 申請人:中國醫學科學院腫瘤研究所