一種酶解微反應器的製備、應用及再生方法
2023-04-26 12:51:06
專利名稱：一種酶解微反應器的製備、應用及再生方法
技術領域：
本發明涉及一種金屬螯合酶反應器的製備以及用於蛋白質鑑定中的應用和該酶解微反應器的再生方法，具體地是指毛細管為載體的金屬螯合型酶解微反應器的製備及在蛋白質的肽譜分析中的應用和該酶解微反應器的再生。
通常固定化酶採用的方法是用共價鍵結合法，即讓酶通過共價鍵與載體結合起來，這種方法的優點是酶和載體的結合比較牢固，酶不易脫落。缺點是合成反應條件比較劇烈，酶活力難免有所損失，另外，製備酶解反應器的過程是相當煩瑣的。這種酶解反應器的固化酶一旦失活，將無法再生而使得整個酶解反應器報廢。
本發明的又一目的在於提供一種毛細管金屬螯合型酶解微反應器在蛋白質鑑定中的應用，其蛋白質樣品的使用量可以達到pmol甚至fmol級，降低了分析成本。
本發明的另一目的在於提供一種毛細管金屬螯合型酶解微反應器的再生方法，使該酶解微反應器可以反覆使用。
為實現上述目的，本發明提供的一種毛細管金屬螯合型酶解微反應器的製備方法，其反應如下 具體製備過程為1)採用羧甲基化氨衍生物如羧甲基化氨衍生物為亞氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝腦三乙酸或羧甲基化的天冬氨酸作為螯合試劑，其用量為2.0-10.0g/100ml，γ-縮水甘油醚基丙基三甲氧基矽烷為偶聯劑，其用量為0.6-3.0ml/100ml，先將螯合劑配製成pH＝11的水溶液，再加入偶聯劑，加熱攪拌下反應4-8小時，配製生成帶螯合基團的矽烷化試劑；2)以內徑25-100μm的石英或玻璃毛細管為載體，用濃硝酸衝洗15-45分鐘，氫氟酸或氟化氫銨溶液蝕刻8-16小時；3)將矽烷化試劑循環通過蝕刻的毛細管進行反應，反應時間為1.5-4小時；4)用硫酸銅溶液對矽烷化的毛細管加載Cu2+，加載時間為1-3小時；5)將胰蛋白酶溶液通過矽烷化的毛細管加載酶，加載時間為1-3小時，用pH＝8的磷酸鹽緩衝溶液將未螯合的胰蛋白酶衝洗乾淨，製得毛細管金屬螯合型酶解微反應器。
本發明提供的一種毛細管金屬螯合型酶解微反應器用於肽譜分析，其具體方法為1)將製備好的毛細管金屬螯合型酶解微反應器吸入樣品溶液，兩端密封，50℃保溫10-30分鐘；2)將含有基體的有機溶液點在樣品耙上，乾燥後在耙上形成一層薄膜，所用基體可以是α-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5-二羥基苯甲酸，有機溶液可以是丙酮或乙醇；3)將毛細管金屬螯合型酶解微反應器中的水解產物直接吹出點在基體膜層上，乾燥；4)再點加含有基體的三氟乙酸/乙腈溶液，乾燥後送入質譜儀進行分析。
本發明提供的一種毛細管金屬螯合型酶解微反應器的再生方法，其步驟為1)用EDTA溶液和水衝洗毛細管；2)用硫酸銅溶液對矽烷化的毛細管加載Cu2+，加載時間為1-3小時；3)將胰蛋白酶溶液通過矽烷化的毛細管加載酶，加載時間為1-3小時；4)用pH＝8的磷酸鹽緩衝溶液將未螯合的胰蛋白酶衝洗乾淨，即完成毛細管金屬螯合型酶解微反應器的再生。
為進一步了解本發明的技術特徵，列舉實施例並結合附圖對本發明作具體描述。
(2)以內徑25μm的熔融石英毛細管為載體，用濃硝酸衝洗30分鐘，再用氟化氫銨溶液對毛細管蝕刻12小時，之後分別用水、濃鹽酸、水衝洗乾淨。
(3)將第(1)步反應生成的GLYMO-IDA-SILANE循環通過蝕刻好的毛細管，反應時間3小時，反應完後用水將殘餘的矽烷化試劑衝洗掉，用甲醇灌滿整個毛細管，兩端封口保存。
(4)將第(3)步矽烷化好的毛細管用水衝洗乾淨後，用EDTA溶液衝洗，去除毛細管中的殘餘的金屬離子，然後用水衝淨，用CuSO4溶液加載Cu2+，加載時間2小時，然後再用水將剩餘的Cu2+去掉；用注射器將新配製的胰蛋白酶溶液通過毛細管加載酶，時間2小時，用pH＝8的磷酸鹽緩衝溶液將未螯合的胰蛋白酶衝洗乾淨，製得毛細管金屬螯合型酶解反微應器。
實施例2、(1)以三羧甲基乙二胺(tris(carboxymethyl)ethylenediamine，TED)為螯合劑，用量為3g，γ-縮水甘油醚基丙三甲氧基矽烷1ml，加熱攪拌反應時間4小時，其餘同實施例1。
(2)以內徑100μm的玻璃毛細管為載體，濃硝酸衝洗15分鐘，再用氫氟酸對毛細管蝕刻8小時。其餘條件同實施例1。
(3)反應時間在1.5小時。其餘條件同實施例1。
(4)用CuSO4溶液加載Cu2+，加載時間1小時，將新配製的胰蛋白酶溶液通過毛細管加載酶，時間1小時。其餘條件同實施例1。
實施例3、(1)以硝腦三乙酸(nitrolotriacetic acid，NTA)為螯合劑，用量5g，γ-縮水甘油醚基丙三甲氧基矽烷1.5ml，加熱攪拌反應時間8小時，其餘同實施例1。
(2)以內徑50μm的石英毛細管為載體，濃硝酸衝洗45分鐘，再用氫氟酸對毛細管蝕刻16小時。其餘條件同實施例1。
(3)反應時間在4小時。其餘條件同實施例1。
(4)用CuSO4溶液加載Cu2+，加載時間3小時，將新配製的胰蛋白酶溶液通過毛細管加載酶，時間3小時。其餘條件同實施例1。
實施例4、用實施例1製備的毛細管金屬螯合型酶解微反應器進行蛋白質的肽分析，其方法如下用0.01M NH4HCO3緩衝溶液配製1μM馬心細胞色素C溶液，將此溶液加熱20分鐘去活，室溫冷卻。截取10cm的製備好的毛細管酶解微反應器，然後緩慢吸入樣品溶液，將兩端密封住，50℃保溫15分鐘。取0.5μlα-氰基-4-羥肉桂酸(CHCA)的丙酮水溶液點在清洗乾淨的樣品耙上，冷風加速吹乾，使基體首先在耙上形成一層均勻的薄膜，然後將毛細管酶解微反應器中的水解產物直接吹出點在基體膜層上，迅速吹乾，點加CHCA的三氟乙酸(TFA)/乙腈溶液0.5μl，待其乾燥後，用0.1％TFA溶液清洗1-3次，氮氣吹乾。送入質譜儀進行分析。所得質譜圖見
圖1。
實施例5、用0.01M NH4HCO3緩衝溶液配製20nM馬心細胞色素C溶液，此溶液加熱30分鐘，取1.5μl 2，5-二羥基苯甲酸的乙醇水溶液點在清洗乾淨的樣品耙上，其餘操作以及條件與實施例4相同。所得質譜圖見圖2。
實施例6、用0.01M NH4HCO3緩衝溶液配製1μM牛血清白蛋白溶液，取1.0μlα-氰基-4-羥肉桂酸(CHCA)的乙醇水溶液點在清洗乾淨的樣品耙上，，其餘操作以及條件與實施例4相同。所得質譜圖見圖3。
實施例7、毛細管金屬螯合型酶解微反應器的再生用EDTA溶液衝洗毛細管，將毛細管酶解微反應器中的Cu2+和胰蛋白酶衝洗掉，然後用水衝洗淨，按照實施例1中第(4)步所述的方法重新加載酶。再生後的毛細管金屬螯合型酶解微反應器按照實施例4所述的分析方法檢測馬心細胞色素C的肽譜圖見圖4。
權利要求
1.一種酶解微反應器的製備方法，其反應如下 其具體步驟為1)採用羧甲基化氨衍生物作為螯合試劑，γ-縮水甘油醚基丙基三甲氧基矽烷為偶聯劑，先將螯合劑配製成pH＝11的水溶液，再加入偶聯劑，加熱攪拌下反應數小時，配製生成帶螯合基團的矽烷化試劑；2)以石英或玻璃毛細管為載體，用濃硝酸衝洗後，氫氟酸或氟化氫銨溶液蝕刻；3)將矽烷化試劑循環通過蝕刻的毛細管進行反應；4)用硫酸銅溶液對矽烷化的毛細管加載Cu2+；5)將胰蛋白酶溶液通過矽烷化的毛細管加載酶，用pH＝8的磷酸鹽緩衝溶液將未螯合的胰蛋白酶衝洗乾淨，製得毛細管金屬螯合型酶解微反應器。
2.如權利要求1所述的酶解微反應器的製備方法，其特徵在於，步驟1)所述羧甲基化氨衍生物為亞氨基二乙酸、三羧甲基乙二胺、硝腦三乙酸或羧甲基化的天冬氨酸；加熱攪拌時間為4-8小時。
3.如權利要求1所述的酶解微反應器的製備方法，其特徵在於，步驟2)所述毛細管的為內徑25-100μm，濃硝酸衝洗時間為15-45分鐘，蝕刻時間為8-16小時。
4.如權利要求1所述的酶解微反應器的製備方法，其特徵在於，步驟3)所述矽化烷反應時間為1.5-4小時。
5.如權利要求1所述的酶解微反應器的製備方法，其特徵在於，步驟4)所述加載Cu2+時間為1-3小時。
6.如權利要求1所述的酶解微反應器的製備方法，其特徵在於，步驟5)所述加載酶時間為1-3小時。
7.一種酶解微反應器的應用，其具體方法為1)將製備好的毛細管金屬螯合型酶解微反應器吸入樣品溶液，兩端密封，50℃保溫10-30分鐘；2)將含有基體的有機溶液點在樣品耙上，乾燥後在耙上形成一層薄膜；3)將毛細管金屬螯合型酶解微反應器中的水解產物直接吹出點在基體膜層上，乾燥；4)再點加含有基體的三氟乙酸/乙腈溶液，乾燥後送入質譜儀進行分析。
8.如權利要求7所述的酶解微反應器的應用，其特徵在於，所述基體為α-氰基-4-羥基肉桂酸或2，5-二羥基苯甲酸。
9.如權利要求7所述的酶解微反應器的應用，其特徵在於，所述有機溶液為丙酮或乙醇。
10.一種酶解微反應器的再生方法，其步驟為1)用EDTA溶液和水衝洗毛細管；2)用硫酸銅溶液對矽烷化的毛細管加載Cu2+，加載時間為1-3小時；3)將胰蛋白酶溶液通過矽烷化的毛細管加載酶，加載時間為1-3小時；4)用pH＝8的磷酸鹽緩衝溶液將未螯合的胰蛋白酶衝洗乾淨。
全文摘要
一種酶解微反應器的製備、應用及再生方法，以石英或玻璃毛細管為載體，採用羧甲基化氨衍生物作為螯合試劑，γ－縮水甘油醚基丙基三甲氧基矽烷為偶聯劑，將胰蛋白酶溶液通過矽烷化的毛細管加載酶，製得毛細管金屬螯合型酶解微反應器。該反應器可應用於肽譜分析，並且可以再生。
文檔編號C12M1/40GK1415734SQ01136860
公開日2003年5月7日 申請日期2001年10月30日 優先權日2001年10月30日
發明者雷政登, 郭忠, 鄒漢法, 張清春, 孔亮 申請人:中國科學院大連化學物理研究所