一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片的製作方法

2023-05-18 13:35:21 2

專利名稱：一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片的製作方法
技術領域：
本實用新型涉及生化檢測領域，具體地說涉及一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片。
背景技術：
目前，在化學和生命科學的研究中，突光(Fluorescence)和化學發光是應用最為廣泛的高靈敏度定量檢測方法之一。由於螢光基團的光子能量吸收效率高，分子中的受激螢光基團可以釋放大量的光能，產生較高強度的光信號，因而，對樣品的預處理簡單，檢測方便。但是，由於受激樣品本身含有複雜的背景螢光基團，會產生非特異的激發螢光，激發光源複雜的光譜會干擾螢光的光探測器檢測，因而，需要有各種濾光裝置才能保證樣品測量的質量。不同於螢光，生物化學發光是一種特異性生化反應促發的自發光，不需要外部光源的激發，因而，具有背景噪聲小、響應迅速和檢測閾值低等優點。化學發光 (Chemiluminescence)是它主要是依據待測物與具有特異性試劑混合產生發光物而表明待測物的存在和濃度，生物發光(bioluminescence)則是依靠存在於螢火蟲和發光細菌等生物體內的酶，催化特異性化學反應產生的能量發光而表明待測物的存在和濃度。生物化學發光檢測正是利用了上述反應體系中待測物濃度與發光強度在一定條件下呈定量關係的特性，通過檢測體系發光強度確定待測物含量。這已經成為較常用的高靈敏度生物化學分析方法。近20年發展起來的微流控技術，以其集成化、微量化、分析速度快、準確度高等優勢，被廣泛應用於生化檢測、醫學研究、環境監測等領域。微流控晶片可在一片晶片上完成進樣、混合、反應、檢測等多個溶液操控步驟，也可以在一片晶片上實現多個液體流路通道的立體結構，進行多個樣品的高通量檢測。將微流控晶片技術與生物化學發光檢測技術相結合，解決多種試劑的傳導、混合等步驟的一體化操控建立發光體系；將微流控晶片技術與光電檢測技術相結合，利用光電二極體、光電耦合器(CCD)、光電倍增管等檢測器件實現穩定和高靈敏度原位光電檢測，以期在保證檢測靈敏度的前提下，提高生物化學發光檢測的通用性和便捷性，減少試劑消耗和提高檢測速度，是目前微流控晶片技術的重要研究和技術開發方向。目前，文獻報導的與發光檢測有關的微流控晶片存在著以下一些缺點1、依賴顯微鏡平臺或透鏡和濾光片組成的複雜光路如申請號為200910114403. 8的中國專利公開的微流控晶片化學發光測定人單個血紅細胞內物質的方法和申請號為201110153526. X的中國專利公開的生物晶片螢光微光譜檢測裝置及製作方法；2、流路結構單一，進樣未經充分混合從而導致反應效率較低，無法達到最大發光強度如申請號為200910154432. 7的中國專利公開的毛細管電泳分離和化學發光檢測的微流控晶片；3、發光區域全透明，不同方向的散射光沒有被充分利用，光檢測效率低
實用新型內容
[0005]本實用新型的目的是為了解決目前微流控晶片存在的與發光檢測有關的上述三個技術問題而提供一種用於生物化學發光檢測的新型微流控晶片，本實用新型的微流控晶片通過改善溶液混合程度提高生物化學反應發光強度，改善光學設計提高光檢測效率，從而提高生物化學發光檢測的操作便捷性和檢測靈敏度。本實用新型實現其技術目的所採用的技術方案是一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，所述晶片包括由上到下依次設置的接口層、透光層、溝道層、反光層和固定層，所述的各層之間通過粘合上下連接並通過緊固件固定，所述的接口層上設有進液孔、出液孔和光纖接孔，所述的溝道層上設有依次連通的進液流動通道、微混合器、檢測池、廢液緩衝池，所述的進液流動通道與進液孔連通，廢液緩衝池與出液孔連通，所述的光纖接孔設置在檢測池的上方，光纖接孔與檢測池之間隔有透光層，檢測池的上部與透光層的下表面相接，檢測池的底部與反光層連接。該微流控晶片通過依次設置接口層、透光層、溝道層、反光層和固定層，並在晶片上設置進液孔、進液流動通道，微混合器，檢測池，廢液緩衝區，出液孔，光纖接孔，上述結構使得進樣從進液孔進入進液流動通道，然後通過微混合器後被充分混合，混合後的發光反應速率大大提高。光纖接孔設置在檢測池的上方，光纖接孔與檢測池之間隔有透光層，檢測池的上部與透光層的下表面相接，檢測池的底部與反光層連接，透光 層設置在光纖接孔與檢測池之間既可以避免光纖與溶液直接接觸引起的光纖和溶液汙染以及流路不平滑，同時又保證檢測池與光纖之間的良好透光性。進液孔和出液孔用於插入進液細管和出液細管，對著檢測池處的光纖接孔，用於插入光纖。該微流控晶片不需要依賴顯微鏡平臺或透鏡和濾光片組成的複雜光路，不需要外部激發光源，不需要施加外部高壓電場驅動流路，採用微混合器，設計特定的流路結構，溶液經進樣和混合器流通通道後，就能夠達到最大發光強度，發光區域採用反光結構，射向光纖接孔以外不同方向的散射光也能夠被充分利用，光檢測效率高。作為優選，所述的接口層上設有若干個進液孔，所述的進液孔的孔徑為Imm 2_，接口層上設置有一個出液孔和一個光纖接孔，所述的出液孔的孔徑為I. 5mm 2. 5_。進液孔的數量根據需要可以設置為多個，以滿足不同檢測目的的需要。進液孔徑與蠕動泵的進液流路管的尺寸適配，出液孔徑與出液流路管的尺寸適配，所述的光纖接孔的孔徑為I. 5mm 5. Omm0作為優選，溝道層上設有與接口層上進液孔數目一致的若干個進液流動通道，每個進液流動通道分別與微混合器連通，所述的進液流動通道的寬度為I. 5mm 2. 5_，深度為Imm 2mm。在溝道層上設置有與接口層上進液孔數目一致的若干個進液流動通道，這樣的結構使得多個通道上的不同進樣在微混合器中得到充分混合，從而提高反應速度和效率。作為優選，所述的微混合器呈折線形溝道、方形內設交叉線形溝道或矩形內設並排溝道形結構，微混合器溝道的寬度和深度分別為O. 5mm I. 5_。微混合器呈折線形溝道、方形內設交叉線形溝道或矩形內設並排溝道形結構，可使多種溶液在快速通過的同時發生充分混合。當然微混合器還可以採用S形等其他結構，只要能夠滿足本技術方案的目的都在本方案的保護範圍之內。作為優選，所述的檢測池呈圓孔形，所述的檢測池的容積小於與廢液緩衝池的容積。為保證檢測池發出的光充分耦合進光纖，檢測池設置為圓孔形結構，底部是反光層，檢測池的直徑(d)應與溝道層厚度(h)、光線芯徑及數值孔徑(α)相匹配，檢測池的孔徑⑷與溝道層厚度(h)、光纖芯徑及數值孔徑(α)滿足
+ 所述的數值孔徑(α)是由光纖材料和光纖芯徑決定的，檢測池前端連
接廢液緩衝池，檢測池的容積小於廢液緩衝池容積，是為了防止廢液倒流入檢測池而影響檢測效果。作為優選，接口層的厚度為2mm 7. 5mm。接口層的厚度優選為2mm 7. 5mm, —是可以選用厚度2mm 7. 5mm的聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)材質基片作為接口層，選材方便，二是這樣的結構使得進液孔、出液孔以及光纖接孔的深度設置為最佳，方便進樣的流入和流出，以及光纖插入後連接長度達到最佳。作為優選，透光層的厚度為O. 2mm O. 8mm。透光層的厚度優選為O. 2mm O. 8mm,可以選用厚度O. 2mm O. 8mm的聚對苯二甲酸乙二酯(PET)薄膜作為透光層,在接口層與 溝道層中間設置O. 2_ O. 8_的透光層可以避免光纖與溶液直接接觸引起的光纖和溶液汙染以及流路不平滑，同時又保證檢測池與光纖之間的良好透光性。作為優選,溝道層的厚度為2. 5mm 3. 5mm。溝道層的厚度優選為2. 5mm 3. 5mm,可以採用厚度2. 5mm 3. 5mm的PMMA材質基片作為溝道層，這樣可以在溝道層上設置適合寬度和深度的依次連通的進液流動通道、微混合器、檢測池、廢液緩衝池，各通道寬度和深度設置為I. 5mm 2. 5mm和1_ 2mm,目的是維持一個合適的流路阻力,保證進液在螺動泵驅動下通暢運行，同時溶液在通道中不會滯留過久；進液流動通道長度為5_ 10_，前端連接微混合器。作為優選,反光層的厚度為O. 8mm 3. 5mm。反光層的厚度優選為O. 8mm I. 5mm,可以先用O. 8_ 3. 5mm的鏡面作為反光層，由於生物化學發光是無定向的，鏡面可以將很大一部分散射光反射到光纖埠，提高了光檢測效率。作為優選，固定層的厚度為2mm 7. 5mm。固定層厚度優選為2mm 7. 5mm,這樣可以選用厚度為2_ 7. 5mm的PMMA材質基片作為固定層,設置在反光層下面,用來加固
-H-* I I
心/T O與現有技術相比，本實用新型的有益效果是(I)檢測溶液經微混合器發生快速而充分的混合，提高了反應發光強度；(2)發光檢測池下方的反光層鏡面可以減少散射光損失，提高了光檢測效率；(3)發光檢測池尺寸根據光纖芯徑和數值孔徑優化設計，達到較優的光耦合效率，同時免去了複雜的透鏡等光路裝置；(4)該微流控晶片製作方法簡單，操作方便，檢測速度快，檢測靈敏度高。

圖I為本實用新型用於生物化學發光檢測的微流控晶片的一種結構示意圖；圖2為圖I的A-A剖視示意圖；圖3為實施例的測試結果的光子計數相應曲線圖；圖4是本實用新型用於生物化學發光檢測的微流控晶片的另一種結構示意圖；[0025]圖5是本實用新型用於生物化學發光檢測的微流控晶片的第三種結構示意圖；圖中1、接口層，11、進液孔，12、出液孔，13、光纖接孔，2、透光層，3、溝道層，31、進液流動通道，32、微混合器，33、檢測池，34、廢液緩衝池，4、反光層，5、固定層，6、緊固件。
具體實施方式
下面通過具體實施例並結合附圖對本實用新型的技術方案作進一步具體說明，所需原料或原件均可市售或常規方法合成。實施例I :如圖I所示，一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，晶片包括由上到下依次設置的接口層I、透光層2、溝道層3、反光層4和固定層5，各層之間通過粘合劑上下粘接在一起並通過四套的緊固件6固定，接口層I為PMMA材質基片，接口層I的厚度為4_，接口 層I上設置有2個直徑Imm的進液孔11、一個直徑I. 5mm的出液孔12、一個直徑2. 25mm的光纖接孔13，溝道層3採用厚度3_的PMMA材質基片，溝道層3上設有依次連通的兩條進液流動通道31、一個微混合器32、一個檢測池33、一個廢液緩衝池34，各通道寬度為2mm，深度I. 5mm ;進液流動通道31的長度為5_，前端連接微混合器32 ;微混合器32為折線形，單折長度為IOmm,溝道寬度為O. 5mm,深度為O. 6mm,溝道間距為Imm,微混合器32前端連接檢測池33，微混合器32和檢測池33之間連接長度為I. 5mm ;檢測池33為直徑4mm的圓
孔孔徑d根據公式d > 2h · :* + 0計算得到，本實施例中溝道層厚度3mm，所選用的光纖
芯徑為Imm及數值孔徑為O. 37)，底部是反光層4，反光層4採用厚度為1mm，長寬尺寸為24mmx24mm的鏡面，檢測池33的前端連接廢液緩衝池34，連接長度為2mm ;廢液緩衝池34的直徑為6mm,深度為2. 7_。進液流動通道31與進液孔11連通，廢液緩衝池34與出液孔12連通，光纖接孔13設置在檢測池33的上方，光纖接孔13與檢測池33之間隔有透光層2，檢測池33的上部與透光層(2)的下表面相接，檢測池33的底部與反光層4連接。固定層5為PMMA材質基片
7.5mm，長寬尺寸為50mmX 50mm，在四角位置有直徑5mm的緊固孔。緊固件6將接口層I、透光層2、溝道層3、反光層4和固定層5緊固成一體，構成用於生物化學發光檢測的微流控晶片(見圖2)。實施例2:在圖4所示的實施例中，一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，晶片包括由上到下依次設置的接口層I、透光層2、溝道層3、反光層4和固定層5，各層之間通過粘合劑上下粘接在一起並通過四套緊固件6固定，接口層I為PMMA材質基片，接口層I的厚度為
3.5mm，接口層I上設置有3個直徑I. 5mm的進液孔11、一個直徑2mm的出液孔12、一個直徑I. 5mm的光纖接孔13，溝道層3採用厚度2. 5mm的PMMA材質基片，溝道層3上設有依次連通的3條進液流動通道31、一個微混合器32、一個檢測池33、一個廢液緩衝池34，各通道寬度為1mm，深度Imm ;進液流動通道31的長度為7. 5mm，前端連接微混合器32 ;微混合器32為方形內設交叉線形溝道,交叉溝道單條長度為IOmm,溝道寬度為Imm,深度為O. 5mm,微混合器32前端連接檢測池33，微混合器32和檢測池33之間連接長度為O. 5mm ;檢測池33為直徑3_的圓孔(本實施例中所選用的光纖芯徑為O. 8mm及數值孔徑為O. 37)，底部是反光層4,反光層4採用厚度為O. 8mm,長寬尺寸為24mmx24mm的鏡面，檢測池33的前端連接廢液緩衝池34，連接長度為2mm ;廢液緩衝池34的直徑為5mm，深度為2. 5mm。進液流動通道31與進液孔11連通，廢液緩衝池34與出液孔12連通，光纖接孔13設置在檢測池33的上方，光纖接孔13與檢測池33之間隔有透光層2，檢測池33開設至溝道層3的下表面，檢測池33的底部與反光層4連接。固定層5為3mm的PMMA材質基片，長寬尺寸為50mmX 50mm,在四角位置有直徑5mm的緊固孔。緊固件6將接口層I、透光層2、溝道層3、反光層4和固定層5緊固成一體，構成生物化學發光檢測的微流控晶片。實施例3 在圖5實施例中，一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，晶片包括由上到下依次設置的接口層I、透光層2、溝道層3、反光層4和固定層5，各層之間通過粘合劑上下粘接在一起並通過四套緊固件6固定，接口層I為PMMA材質基片，接口層I的厚度為4. 5mm，接 口層I上設置有4個直徑2_的進液孔11、一個直徑2. 5mm的出液孔12、一個直徑5_的光纖接孔13，溝道層3採用厚度3. 5mm的PMMA材質基片，溝道層3上設有依次連通的4條進液流動通道31、一個微混合器32、一個檢測池33、一個廢液緩衝池34，各通道寬度為I. 5mm,深度2_ ;進液流動通道31的長度為10_，前端連接微混合器32 ;微混合器32為或矩形內設並排溝道形結構，並排溝道單條長度為IOmm,溝道寬度為O. 8mm,深度為Imm,溝道間距為1mm，微混合器32前端連接檢測池33，微混合器32和檢測池33之間連接長度為2mm ;檢測池33為直徑5. 5mm的圓孔(本實施例中所選用的光纖芯徑為1_及數值孔徑為O. 5)，底部是反光層4,反光層4採用厚度為I. 5mm,長寬尺寸為24_x24_的鏡面，檢測池33的前端連接廢液緩衝池34，連接長度為2mm ;廢液緩衝池34的直徑為6. 5mm，深度為3mm。進液流動通道31與進液孔11連通，廢液緩衝池34與出液孔12連通，光纖接孔13設置在檢測池33的上方，光纖接孔13與檢測池33之間隔有透光層2，檢測池33開設至溝道層3的下表面，檢測池33的底部與反光層4連接。固定層5為2mm的PMMA材質基片，長寬尺寸為50mmX 50mm,在四角位置有直徑5mm的緊固孔。緊固件6將接口層I、透光層2、溝道層3、反光層4和固定層5緊固成一體，構成生物化學發光檢測的微流控晶片。實施例I、實施例2或實施例3中任一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片的製作方法為以下步驟，I) 使用雷射打標機在接口層I上刻出進液孔11、出液孔12、光纖接孔13，在透光層2上刻出進液孔11、出液孔12，在溝道層3上刻出進液流動通道31、微混合器32、檢測池33、廢液緩衝池34，在接口層I、透光層2、溝道層3和固定層5上分別刻出緊固孔；的進液孔11的孔徑為Imm 2mm,出液孔12的孔徑為I. 5mm 2. 5mm,光纖接孔13的孔徑為
I.5mm 5. Omm。進液流動通道31的寬度為I. 5mm 2. 5mm,深度為1_ 2mm,微混合器32溝道的寬度和深度分別為O. 5mm I. 5mm,檢測池33圓孔形,檢測池33的孔徑(d)與溝
道層厚度(h)、光纖芯徑及數值孔徑(α)滿足+ 數值孔徑(α)
> I—-
是由光纖材料和光纖芯徑決定的，所述的檢測池33的容積小於與廢液緩衝池34的容積；2) 粘合劑的製備由聚二甲基矽氧烷單體與固化劑按照體積比為3 20:1混合製成，靜置到氣泡消失為止，所述的聚二甲基矽氧烷單體(PDMS)及固化劑為市購產品；PDMS 可選用 Dow Corning 的 Sylgard 184 silicone elastomer base,固化劑可選用 DowCorning 的 Sylgard 184 silicone elastomer curing agent ；3)使用步驟2中製備的粘合劑塗覆各層之間的接觸面，並將接口層I、透光層2、溝道層3、發光層4和固定層5由上到下疊放，在四角位置用緊固件6緊固，然後置於70 90°C烘箱中固化60 120分鐘製成用於生物化學發光檢測的微流控晶片。 把實施例I、實施例2或實施例3中任一製得的用於生物化學發光檢測的微流控晶片用於ATP生物發光檢測的流程如下I)在用於生物化學發光檢測的微流控晶片，接口層I上的進液孔11通過進液流路管與蠕動泵(型號LongerPump BT100-2J)連接，出液孔12與出液流路管連接，檢測光纖一端插入光纖接孔13，另一端連接至光子計數器(IDQ idl00-MMF50-ULN)，將光子計數器連接至計算機上；蠕動泵的數目與進液孔的數目一致；進液孔11與進液流路管、出液孔12與出液流路管連接、檢測光纖與光纖接孔13分別使用粘合劑固化，粘合劑選自乙烯-醋酸乙烯 熱熔膠。2)洗清流路，依次用O. I lmol/L的鹼溶液，O. I lmol/L酸溶液，O. I Imol/L的鹼溶液，以luL/s 10uL/S的流速衝洗微流控晶片的液體流路通道和溶液池，再用超純水，以luL/s 10uL/S的流速衝洗微流控晶片的液體流路通道和溶液池；3)以O. luL/s 3uL/s的流速向進液流動通道11內分別通入15uL IOOuL螢光素酶發光檢測液和15uL IOOuL含ATP的樣品液，即可測得生物發光反應的光子計數響應曲線(圖3-1)。比較例I參照實施例f 3製作的用於生物化學發光檢測的微流控晶片，，區別在於不含反光層。參照實施例廣3用於ATP生物發光檢測，測得響應曲線(圖3-2)。比較例2參照實施例f 3製作的用於生物化學發光檢測的微流控晶片，，區別在於溝道層上無微混合器，進液流動通道直接匯入檢測池。參照實施例廣3用於ATP生物發光檢測，測得響應曲線(圖3-3)。比較例3參照實施例f 3製作的用於生物化學發光檢測的微流控晶片，，區別在於不含反光層，且溝道層上無微混合器，進液流動通道直接匯入檢測池。參照實施例廣3用於ATP生物發光檢測，測得響應曲線(圖3-4)。上述實施例只是對本實用新型技術方案的說明而不是限制，本技術領域中普通技術人員在本技術方案的基礎上所作的任何替代都在本實用新型技術方案的保護範圍之內。
權利要求1.一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於所述晶片包括由上到下依次設置的接口層(I)、透光層(2)、溝道層(3)、反光層(4)和固定層(5)，所述的各層之間通過粘合上下連接並通過緊固件(6 )固定，所述的接口層(I)上設有進液孔(11 )、出液孔(12)和光纖接孔(13)，所述的溝道層(3)上設有依次連通的進液流動通道(31)、微混合器(32 )、檢測池(33 )、廢液緩衝池(34 )，所述的進液流動通道(31)與進液孔(11)連通，廢液緩衝池(34)與出液孔(12)連通，所述的光纖接孔(13)設置在檢測池(33)的上方，光纖接孔(13)與檢測池(33)之間隔有透光層(2)，檢測池(33)的上部與透光層(2)的下表面相接，檢測池(33 )的底部與反光層(4 )連接。
2.根據權利要求I所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於所述的接口層(I)上設有若干個進液孔(11)，所述的進液孔(11)的孔徑為Imm 2mm，接口層(I)上設置有一個出液孔(12)和一個光纖接孔(13)，所述的出液孔(12)的孔徑為I. 5mm .2.5mm,所述的光纖接孔(13)的孔徑為I. 5mm 5. Omm。
3.根據權利要求I或2所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於溝道層(3 )上設有與接口層(I)上進液孔(11)數目一致的若干個進液流動通道(31)，每個進液流動通道(31)分別與微混合器(32)連通，所述的進液流動通道(31)的寬度為I. 5_ .2.5mm,深度為 Imm 2mm。
4.根據權利要求I所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於所述的微混合器(32)呈折線形溝道、方形內設交叉線形溝道或矩形內設並排溝道形結構，微混合器(32)溝道的寬度和深度分別為O. 5mm I. 5mm。
5.根據權利要求I所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於所述的檢測池(33)呈圓孔形，所述的檢測池(33)的容積小於廢液緩衝池(34)的容積。
6.根據權利要求I或2或4或5所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於接口層(I)的厚度為2mm 7. 5mm。
7.根據權利要求I或2或4或5所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於透光層(2)的厚度為O. 2mm O. 8mm。
8.根據權利要求I或2或4或5所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於溝道層(3)的厚度為2. 5mm 3. 5mm。
9.根據權利要求I或2或4或5所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於反光層(4)的厚度為O. 2mm 3. 5mm。
10.根據權利要求I或2或4或5所述的一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，其特徵在於固定層(5)的厚度為2mm 7. 5mm。
專利摘要本實用新型公開了一種用於生物化學發光檢測的微流控晶片，晶片包括由上到下依次設置的接口層、透光層、溝道層、反光層和固定層，各層之間通過粘合上下連接並通過緊固件固定，接口層上設有進液孔、出液孔和光纖接孔，溝道層上設有依次連通的進液流動通道、微混合器、檢測池、廢液緩衝池，進液流動通道與進液孔連通，廢液緩衝池與出液孔連通，光纖接孔設置在檢測池的上方，光纖接孔與檢測池之間隔有透光層，檢測池開設至溝道層的下表面，檢測池的底部與反光層連接。該微流控晶片提高了檢測溶液反應發光強度，提高了光檢測效率；製作簡單，操作方便，檢測速度快，檢測靈敏度高，檢測結果準確。
文檔編號G01N21/76GK202599845SQ20122023633
公開日2012年12月12日 申請日期2012年5月24日 優先權日2012年5月24日
發明者張武明, 李振煜, 王酉, 葉杭慶, 李光 申請人:浙江大學