新型生理活性物質的製作方法

2023-05-17 21:52:31

專利名稱：新型生理活性物質的製作方法
技術領域：
本發明涉及對動物或動物組織給予內·外應激物，在由活化組織提取出的物質中加入矽酸鹽，或提取使之達到高矽酸含量，得到的高活性新型生理活性物質。
生物體應對內外環境的變化，將生物體的物理、化學狀態調節或維持在某一穩定的生理條件內，以維持個體的生命。為了維持調節生物體的上述內穩態，時常在生物體內產生各種物質，同時在病毒、細菌等侵入時或出現腫瘤細胞時，對這些內、外侵襲的抵抗物質也一同在體內產生。
但是，任何原因都可造成生體機能失去平衡，如果變成慢性，就將出現所謂病態的各種疾病。疾病的理想治療方法是使保持生物體內穩態的機能活化或對其進行調節，使紊亂的生體機能的病態失調恢復到正常狀態。眾所周知生體機能的維持或正常化特別是通過細胞表面的各種受體或鈉、鉀、鈣等離子通道進行的。已知隨著年齡的增加，哺乳動物細胞中DNA的損傷修復能力降低，體內產生自由基促進老化、膠原病或癌變，另外膠原是廣泛存在於皮膚、血管、軟骨、眼球、腎臟等處的非細胞物質，隨著年齡的增加膠原出現交聯，失去彈性，變硬。
在抗原抗體反應中，由身體構成細胞中的肥大細胞放出的組胺是造成過敏反應的原因，通過抑制該肥大細胞的破裂，有望使異常病態緩和，趨於正常化。
本發明人著眼於調節、修復病態時產生的伴有生物體細胞機能缺陷的神經系統、內分泌系統失常的生物體內穩態維持機制，對於生物體內特別是在對生物體內、外應激反應的抵抗期生物體內產生的物質，即生物體組織活化時產生的、提高生物體自然治癒能力、使身體機能正常化的物質進行了悉心的研究，發現了具有更高活性的新型生理活性物質，從而完成了本發明。
本發明涉及給各種動物或動物組織接種作為應激物的病毒或腫瘤細胞，使組織活化後，從這些活化組織中提取生理活性物質，向其中添加可溶性矽酸鹽，或提取該生理活性物質使之達到高矽酸含量，得到的高活性新型生理活性物質，具有組胺游離抑制作用以及透明質酸酶活性抑制作用等生理活性，修復病態時產生的機能異常，正常化的生物體功能的調節、維持物質。
本發明的目的在於提供一種具有非常高的生理活性的新型生理活性物質。
本發明的物質是通過將動物的活化組織磨碎，加入提取溶劑除去組織碎片後，進行除蛋白處理，將其用吸附劑吸附，然後在洗脫吸附成分得到的生理活性物質中加入一定量的可溶性矽酸鹽，或用吸附劑進行洗脫操作使之達到高矽酸含量，得到的具有高生理活性的新型生理活性物質。
以下詳細說明本發明。本發明中，動物組織是指人和各種動物的病毒感染培養組織、培養細胞和病毒感染炎症組織或孵化雞蛋的絨毛膜尿囊等，作為用於動物組織活化的應激物的病毒中有痘苗病毒、牛痘病毒、痘瘡病毒、小鼠畸肢病毒、猴痘病毒等原痘病毒，蛇病毒(オ一フウイルス)、副痘苗病毒、牛乳頭狀口內炎病毒等副痘病毒，綿羊痘病毒、山羊痘病毒、銀屑病(塊皮病)病毒等山羊痘病毒，雞痘病毒、野兔纖維腫病毒等鳥痘病毒，兔粘液腫病毒、兔纖維腫病毒等兔痘病毒，其它豬痘病毒、Yava猴腫瘤病毒、Tara痘病毒等屬於痘病毒科的病毒。另外，作為應激物的腫瘤細胞中可以使用來源於人和各種動物細胞的腫瘤培養細胞株，只要是可以接種在上述動物、動物組織中的物質即可。
為了得到活化組織，作為動物可以兔、牛、馬、綿羊、山羊、豬、雞等家畜、家禽類，或猴、大鼠、小鼠、豚鼠、倉鼠等哺乳動物，可以根據使用的應激物的種類或目的適當選擇。另外，作為培養細胞，只要是所使用的應激物可以增殖的培養細胞即可，例如人血細胞或胎盤等各種組織以及上述動物及其胚胎的腎臟、皮膚、肺臟、睪丸、肝臟、肌肉、腎上腺、甲狀腺、腦、神經細胞、血細胞等各組織的培養細胞。
將這些活化組織無菌取出並磨碎，加入其1倍至5倍量的提取溶劑，形成乳化懸濁液。作為提取溶劑可以使用蒸餾水、生理鹽水、弱酸性至弱鹼性的緩衝液，也可以適當添加甘油等穩定劑、苯酚等殺菌·防腐劑、氯化鈉、氯化鉀、氯化鎂等無機鹽類等。這時，通過凍結融解、超聲波、細胞膜溶解酶或表面活性劑等的處理，可以破壞細胞組織而易提取。
將得到的乳狀提取液過濾或離心分離除去組織碎片後，進行除蛋白處理。除蛋白可以採用公知的方法進行，可以採用通過加熱、超聲波、蛋白質變性劑，例如酸、鹼、尿素、胍、有機溶劑、表面活性劑等進行處理、等電點沉澱、鹽析等方法。然後，通過使用濾紙(纖維素、硝基纖維素等)、玻璃濾器、硅藻土、塞氏過濾板(Seitz filter)等進行過濾、超濾、凝膠過濾、離子交換樹脂、離心分離等，除去析出的不溶蛋白質。
將這樣得到的提取部分用鹽酸、硫酸、氫溴酸等酸調節為酸性，優選pH3.5至5.5，用吸附劑進行吸附操作。可以使用的吸附劑例如活性炭、高嶺土、離子交換樹脂等，在提取液中加入吸附劑進行攪拌或使之通過填充有吸附劑的柱，可以吸附有效成分。
自吸附劑洗脫生理活性物質，可以在上述吸附劑中加入提取溶劑，例如鹼性水溶液或醇等的水混合性溶劑或其混合溶液，優選調節為pH9至12，在室溫下或適當加熱或攪拌進行洗脫，通過過濾等常規方法除去吸附劑。然後，必要時通過採用層析法、超濾法、反滲透過濾法的透析法等慣用方法或進行脫鹽處理，可以得到進一步精製的生理活性物質。當這樣由活化組織提取的生理活性物質是乾燥固體時，1mg中按矽換算含有矽類1～20μg。
上述生理活性物質中添加的矽類為水溶性矽酸或矽酸聚合形成的矽酸聚合物及其鹽類，這些物質能夠以原矽酸、偏矽酸、中二矽酸、中三矽酸、中四矽酸等矽酸或其鈉、鉀等鹼金屬鹽、或水玻璃等單體或聚合物的形式加入。另外，能夠以鹼性溶液溶解輕質和重質矽酸酐的形式加入，也可以加入將水晶、石英、長石、花崗巖、橄欖巖等含有大量矽的礦物質用鹼溶解得到的物質或將硅藻土、膨潤土玻璃、活性炭用鹼性物質處理得到的物質，或者加入由矽含量高的木賊、紫芝、杜仲、稻、麥、竹、芒、問荊、海綿、硅藻類等植物或動物或硅藻土中提取的可溶性矽酸鹽。另外，通過活化組織製備生理活性物質的時候，由活性炭、高嶺土、膨潤土等吸附劑洗脫時，由於pH的上升或洗脫時間的延長、洗脫溫度的上升，由吸附劑混入矽類，也可以得到矽酸含量高的本發明生理活性物質。
本發明物質中的矽化合物可以根據其使用目的，並在不防礙其作用的範圍內適當添加到上述生理活性物質中，或使上述生理活性物質中含有本發明物質中的矽化合物。本發明物質中含有的矽類是水溶性的矽酸或矽酸鹽聚合得到的矽酸聚合物，這些物質能夠以原矽酸、偏矽酸、中二矽酸、中三矽酸、中四矽酸等矽酸或其鈉、鉀等鹼金屬鹽等單體或聚合物的形式存在，本發明的物質中1mg乾燥固體按矽換算含有矽類20μg以上。
以下列出本發明的優選方式。
(1)是由活化組織提取、製備的物質，對胺基酸(茚三酮反應)、糖(苔黑酚-氯化鐵III-鹽酸法)、磷(鉬藍法)和矽酸(鉬藍法)的顯色反應為陽性，對蛋白質(三氯醋酸法)和苯酚(氯化鐵試驗法)的定性反應為陰性，1mg乾燥固體中按矽換算含有矽類超過20μg的新型生理活性物質。
(2)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入矽酸鹽。
(3)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入矽酸聚合物。
(4)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入二氧化矽用氫氧化鈉或氫氧化鉀溶解得到的矽酸鹽。
(5)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入由矽含量高的木賊、紫芝、杜仲、稻、麥、竹、芒、問荊、海綿、硅藻類等植物或動物或硅藻土中提取的可溶性矽酸鹽。
(6)如上述(1)所述的生理活性物質，在由活化組織提取的物質中加入將水晶、石英、長石、花崗巖、橄欖巖、玻璃等含有大量矽的巖石類用鹼提取得到的矽酸。
(7)如上述(1)所述的生理活性物質，是在由活化組織提取時，從吸附劑洗脫的操作中增加矽的混入而得到的。
以下是本發明物質的製備方法的實施例。但是，這些實施例並不能限定本發明的範圍。實施例1在健康成熟的家兔皮膚上接種痘苗病毒，使之活化後，將活化的皮膚無菌剝離，將其切細，加入水，用勻漿機磨碎形成乳狀物。然後將其加壓過濾，用鹽酸將得到的濾液調節為pH5.0後，加熱到100℃。過濾除去蛋白後，用氫氧化鈉調節為pH9.1，再在100℃下加熱處理後過濾。用鹽酸將濾液調節為pH4.1，加入活性炭2％，攪拌2小時後過濾。再在濾液中加入活性炭5.5％，攪拌2小時後過濾。在最初過濾得到的活性炭中加入水，用氫氧化鈉調節為pH9.9，在60℃下攪拌1.5小時後過濾。在最初的活性炭和之後的活性炭中加入水，用氫氧化鈉調節為pH10.9，在60℃下攪拌1.5小時後過濾。合併濾液，用鹽酸中和後，在減壓條件下乾燥固化。1kg活化皮膚的收量為4g。以其作為出痘皮膚提取物。該提取物具有以下性質。
(1)性狀淡黃褐色無定形的吸溼粉末。
(2)溶解性可溶於水，不溶於苯、醚。
(3)pH7.5(4)紫外吸收λmax＝270nm(5)顯色反應胺基酸(茚三酮反應陽性)、糖(苔黑酚-氯化鐵III-鹽酸法陽性)、磷(鉬藍法陽性)、蛋白質(三氯醋酸法陰性)、苯酚(氯化鐵試驗法陰性)
在水100mL中加入上述出痘皮膚提取物1g、偏矽酸鈉500mg(按矽為50mg)。用鹽酸將其調節為pH7.5後，在減壓條件下乾燥固化得到粉末狀的本發明生理活性活性物質。實施例2在鉑或鎳的坩堝中加入輕質矽酸酐3g和氫氧化鈉2g，加入水13mL攪拌。再將該坩堝加熱5分鐘使之沸騰後，在該液體中加入水達到100mL。該液體100mL中含有矽1.4g，以其為矽酸溶液。在水100mL中加入實施例1的出痘提取物0.5mg和矽酸溶液2.1mL，調節為pH7.5，在減壓條件下乾燥固化。
本發明的生理活性物質與以往的出痘皮膚提取物相比矽化合物含量高，其生理活性效果例如抑制組胺由肥大細胞游離的作用、抑制透明質酸酶活性的作用、抑制由於組胺回流引起鼻腔內血管通透性的作用、抑制II型變態反應等效果，以下，詳細敘述抑制組胺由肥大細胞游離的作用以及抑制透明質酸酶活性的作用。
(1)抑制組胺由肥大細胞游離的作用將Wistar系大鼠斷頭，按照常規方法從腹腔內取出肥大細胞。在該細胞液中加入試樣溶液和化合物48/80，在37℃下放置10分鐘後，用冰冷卻停止反應，用原甲醛使之發生螢光測定游離組胺。由於添加試樣帶來的組胺游離抑制率用％表示。將試樣溶液中出痘皮膚提取物的濃度調節為15mg/ml，對以各種濃度含有矽類的出痘皮膚提取物考察其抑制組胺游離的作用，確認本發明的生理活性物質具有高活性。一例結果如表1所示。表1
(2)抑制透明質酸酶活性的作用可以說在變態反應PCA炎症反應部位，血管的通透性亢進，同時透明質酸酶活性上升，另外已有抑制透明質酸酶活性可以抑制毛細血管通透性的報導。因此，對於本發明的物質進行抑制透明質酸內活性的試驗。
將透明質酸酶標準溶液(最終濃度5單位/mL)0.5mL和試樣溶液0.5mL在37℃下培養10分鐘後，將該0.1mL加入到透明質酸溶液(150μg/mL)0.9mL中，在37℃下溫育15分鐘。加入含有2.5mg牛血清白蛋白的醋酸緩衝液(pH4.0)5mL，停止反應，5分鐘後精確測定540nm處的吸光度。用生理鹽水代替試樣溶液得到的吸光度作為對照，求出酶活性抑制率。將試樣溶液中出痘皮膚提取物的濃度調節為15mg/mL，對本發明生理活性物質抑制透明質酸酶活性的作用進行考察。一例結果如表2所示。表2
從上述藥理試驗結果可以看出，本發明生理活性物質與從活化組織提取出的現有生理活性物質相比活性非常高，作為抗變態反應劑等藥物是非常有用的。
本發明的生理活性物質與藥用的各種載體或稀釋劑適當組合，按照常規方法可以製成各種製劑，可以製成口服或非口服的固體、半固體、液體或氣霧劑等劑型。在配方中，可以單獨使用本發明的物質，也可以與其它藥物活性成分適當組合。
作為注射劑可以製成水性溶劑或非水性溶劑(例如注射用蒸餾水、生理鹽水、林格氏溶液、植物油、合成脂肪酸甘油酯、高級脂肪酸酯、丙二醇等)的溶液或懸濁液，調節pH達到等滲。另外，可以與食鹽、乳糖、白糖、甘露醇等一同冷凍乾燥，製成用時溶解的注射劑。
作為口服給藥製劑，可以直接或與合適的添加劑適當組合製成片劑、散劑、顆粒劑或膠囊劑，其中添加劑例如乳糖、甘露醇、玉米澱粉、結晶纖維素等常用的賦形劑，以及纖維素衍生物、阿拉伯膠、玉米澱粉、明膠等粘合劑，玉米澱粉、馬鈴薯澱粉、羧甲醚纖維素(carmellose)、羧甲醚纖維素鈣等崩解劑，滑石粉、硬脂酸鎂等潤滑劑，其它增量劑、潤溼劑、緩衝劑、防腐劑、香料等。另外，根據患者的狀態或疾病的種類，也可以製成最適於其治療的上述以外的劑型，例如與高級脂肪酸、高級醇、丙二醇、矽油、液體石蠟、凡士林、各種表面活性劑一起製成霜劑、軟膏，或與ウイテツプ溶膠一起製成栓劑，或製成其它吸入劑、氣霧劑、巴布劑、滴眼劑等適當的製劑。
權利要求
1.新型生理活性物質，是由活化組織提取、製備的物質，對胺基酸(茚三酮反應)、糖(苔黑酚-氯化鐵III-鹽酸法)、磷(鉬藍法)和矽酸(鉬藍法)的顯色反應為陽性，對蛋白質(三氯醋酸法)和苯酚(氯化鐵試驗法)的定性反應為陰性，1mg乾燥固體中按矽換算含有矽類超過20μg。
全文摘要
本發明提供一種具有非常高活性的新型生理活性物質。本發明的生理活性物質是對動物或動物組織給予內外應激物,在由活化組織提取出的物質中加入矽酸鹽,或提取使之達到高矽酸含量得到的。本發明的生理活性物質與從活化組織提取的現有生理活性物質相比活性非常高,作為藥物等非常有用。
文檔編號A61K31/80GK1272365SQ0010659
公開日2000年11月8日 申請日期2000年4月14日 優先權日1999年4月15日
發明者小西甚右衛門 申請人:日本臟器製藥株式會社