一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法
2023-05-18 06:52:16 4
專利名稱：一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法
技術領域：
本發明涉及生物學領域，特別涉及基因工程領域。
目前常規生產基因工程藥用蛋白或其它有益蛋白的方法主要是通過細菌發酵，即把外源基因組裝到細菌基因上，然後培養細菌、收集菌體或外分泌物提取有益蛋白成分，這一方法有以下局限1)、細菌為原核生物，一些對人體有益的蛋白質，其基因往往來源於高等動植物，這些基因在細菌中的表達往往具有低等生物的特徵，如醯胺化，有的根本不能表達。
2)、細菌中本身蛋白質種類繁多，其中大部分是不能被人體吸收利用或是有害的成分。
國外近十年來開始用植物病毒的基因組作為載體表達外源基因，這一方法是把外源基因組裝到植物病毒的基因組上，利用植物病毒的高拷貝快速複製來實現外源基因的高效表達。但此途徑因為破壞了植物病毒複製體系的完整性而只能實現瞬時高表達，即接種植物不能持續、系統地表達基因工程蛋白質。
本發明的目的在於提供一種以植物為生物反應器，持續、高效地表達基因工程蛋白質的方法。
為實現上述目的，本發明採用以下技術方案一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於它以黃瓜花葉病毒(CMV，下同)的衛星RNA作為表達載體，通過構建含外源基因的重組衛星RNA，然後將含外源基因的重組衛星RNA與CMV共同接種植物並表達外源基因，或共同接種植物細胞培養物，並在組織培養條件下表達外源基因；所述含外源基因的重組衛星RNA是指含有一種外源基因的衛星RNA序列，其外源基因的長度為30bp～1800bp，或含有以串聯方式連接的兩種或兩種以上外源基因的衛星RNA序列，其外源基因的總長度為60bp～1800bp。
CMV是一種單鏈的RNA病毒，可接種侵染1000多種植物，如十字花科和茄科蔬菜以及多種藥用植物。CMV衛星RNA是CMV基因組以外的一種遺傳因子，其本身不參與與CMV複製有關的功能而是在CMV的帶動下複製，其在寄主植物細胞中的拷貝數往往可達CMV基因組的數十倍或上百倍。基於以上特點，改變衛星RNA的結構不會破壞CMV複製體系的完整性因而CMV的衛星RNA可以作為一種持續、高效表達基因工程蛋白質的載體。本發明適用面廣，通過在衛星RNA上裝載不同的目的基因並接種侵染不同植物，滿足生產不同的基因工程蛋白質的要求，如具治療、保健、食用作用的蛋白質，且基因工程蛋白質的表達量大大高於已有表達系統。
下面結合實施例對本發明作進一步的描述。
本發明以黃瓜花葉病毒(CMV，下同)的衛星RNA作為表達載體，通過構建含外源基因的重組衛星RNA，然後將含外源基因的重組衛星RNA與CMV共同接種植物並表達外源基因，或共同接種植物細胞培養物，並在組織培養條件下表達外源基因；所述含外源基因的重組衛星RNA是指含有一種外源基因的衛星RNA序列，其外源基因的長度為30bp～1800bp，或含有以串聯方式連接的兩種或兩種以上外源基因的衛星RNA序列，其外源基因的總長度為60bp～1800bp。
本發明所述的轉錄載體是指用常用方法構建的細菌質粒其原理是在常用質粒上，如PUC18、PUC19等，組裝CaMV(花椰菜花葉病毒)的35S啟動子和終止子序列，使得35S啟動子和終止子之間具有裝載外源DNA片段的酶切位點。這類載體如PCASS1、PCASS2、PD-35ST及其構建方法為本領域內常見(參考文獻如SHIBu-Jun等1997 J.Gen.Virology1181-1185)。
本發明所述的逆轉錄、PCR、體外轉錄、用DNA合成儀人工全合成DNA的方法均為分子生物學中的常用方法，其參考文獻如下1、逆轉錄、PCR方法Avila-Rincon MJ，Collmer CW JM Kaper 1986，Virology 152446-434.
錢世鈞、於穎、田開榮等1994，生物工程學報104734-382、PCR方法Rosenberg SM 1987，Meth.Enzymol3、cDNA合成方法Sambrook J，Fritsch E F Maniatis T 1989，Molecular cloningAlaboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory.
4、體外轉錄方法Boyer J C and Haenni A L 1994，Virology 415-4265、轉錄載體構建Ding S W，Rathjen J P，Li W X等於1995，J G Virology 76459-464基因參考文獻1.α-胸腺素基因Eschenfeldt W H，Manrow R E Krug M S等，1989，J Biol Chem.264(13)7546-7555。
2.PF4基因(血小板因子IV)Poncz M，S Surrey， P LaRocco等，1987，Blood 69219-223。
3.氯黴素乙醯轉移酶Sakai R K，Gelfand，D H Stoffel等，1988，Science 2301350-1354。
4.螢光素酶deWet J R 1987，Mol.Cell Biol.7725。
5.胰島素原類似物Wetzel R等1981，Gene 1663-71。
實施例1分離CMV中的衛星RNA，以衛星RNA為模板通過逆轉錄和PCR方法克隆衛星RNA的全長cDNA，在cDNA的96-183位鹼基之間插入α-胸腺素基因(87bp，29個胺基酸)，獲得全長367bp的重組衛星DNA，其兩端包含Stul和EcoRl兩個酶切位點再將重組衛星DNA組裝到PCASS2質粒的35S啟動子的下遊從而獲得含重組衛星DNA的PCASS2質粒，將含重組衛星DNA的PCASS2質粒和不含衛星RNA的CMV共同接種菸草，在CMV的存在下轉錄獲得具有含α-胸腺素基因的重組衛星RNA，用具有含α-胸腺素基因的重組衛星RNA的CMV擴大接種感染菸草，根據植株症狀表現判斷，陽性株率95％以上，7～20天後收集菸草葉片，提取、純化α-胸腺素，α-胸腺素的產率為5～23mg/100g新鮮菸葉。
實施例2以衛星RNA為模板通過逆轉錄和PCR方法克隆衛星RNA的全長cDNA，在cDNA的96-183位鹼基之間以替換方式插入串聯的α-胸腺素基因和PF4基因(血小板因子IV，219bp，71個胺基酸)，獲得全長為536bp的重組衛星DNA，再將重組衛星DNA組裝到PCASS2質粒的35S啟動子的下遊從而獲得含重組衛星DNA的PCASS2質粒，含重組衛星DNA的PCASS2質粒和CMV共同接種菸草，在CMV的存在下轉錄獲得具有含α-胸腺素基因和PF4基因的重組衛星RNA，用具有含α-胸腺素基因和PF4基因的重組衛星RNA的CMV擴大接種菸草，根據植株症狀表現判斷，陽性株率95％以上7～20天後收集菸草葉片，提取、純化α-胸腺素和血小板因子IV，目的蛋白質的總產率為2～10mg/100g新鮮菸葉。
實施例3根據CMV衛星RNA的兩端序列和PF4基因的兩端序列設計並用DNA合成儀合成PCR引物PCR引物中包括酶切位點、衛星RNA的cDNA的兩端序列和PF4基因的兩端序列，用PCR方法進行PCR擴增並將PCR產物組裝到PCASS2轉錄載體的35S啟動子和35S終止子之間，構成含重組衛星DNA的PCASS2質粒，再與不含衛星RNA的CMV共同接種菸草，在CMV的存在下轉錄獲得具有含PF4基因的重組衛星RNA，用具有含PF4基因的重組衛星RNA的CMV通過磨擦接種番茄幼苗，10～20天後用CMV、PF4雙抗檢測接種番茄株，陽性株率60～85％。
實施例4根據CMV中的衛星RNA的cDNA的5』端96個鹼基、α-胸腺素基因的序列和3』端184個鹼基的序列，用DNA合成儀人工全合成一個367個鹼基的DNA序列並在其兩端分別加上Stul和EcoRl兩個酶切位點的序列，從而獲得重組衛星DNA；再將重組衛星DNA組裝到PCASS2質粒的35S啟動子的下遊從而獲得含重組衛星DNA的PCASS2質粒，含重組衛星DNA的PCASS2質粒和CMV共同接種菸草，在CMV的存在下轉錄獲得具有含α-胸腺素基因的重組衛星RNA，用具有含α-胸腺素基因的重組衛星RNA的CMV通過磨擦接種接種感染菸草，根據植株症狀表現判斷，陽性株率95％以上，7～20天後收集菸草葉片，提取、純化α-胸腺素，α-胸腺素的產率為5～23mg/100g新鮮菸葉。
實施例5根據CMV中的衛星RNA的cDNA的5』端96個鹼基、α-胸腺素基因的序列和3』端184個鹼基的序列，用DNA合成儀人工全合成一個367個鹼基DNA序列並組裝到RNA體外轉錄試劑盒中外源DNA載體的T7啟動子的下遊，通過用體外轉錄試劑盒轉錄，獲得重組衛星RNA，再與CMV共同接種無病毒半夏幼苗，獲得被具有含α-胸腺素基因的重組衛星RNA的CMV侵染的半夏，用組織培養方法大量無性繁殖半夏植株，α-胸腺素基因在半夏植株中的表達量為0.01～0.29mg/100g鮮半夏。
實施例6用實施例3的方法獲得PCR產物並組裝到RNA體外轉錄試劑盒中外源DNA載體的T7啟動子的下遊，通過用體外轉錄試劑盒轉錄獲得具有含PF4基因的重組衛星RNA，再與CMV共同接種大白菜的原生質體，獲得被具有含PF4基因的重組衛星RNA的CMV侵染的愈傷組織，檢測愈傷組織中CMV外殼蛋白和PF4，陽性率25～40％，以帶有以上兩種蛋白質的組織繼續擴大培養，在細胞培養水平上獲得PF4因子的高效表達。
實施例7利用實施例1的方法獲得含氯黴素乙醯轉移酶基因(656bp)的重組衛星DNA，並組裝到RNA體外轉錄試劑盒中外源DNA載體的SP6啟動子的下遊，通過用體外轉錄試劑盒轉錄獲得含氯黴素乙醯轉移酶基因的重組衛星RNA，後者與CMV共同接種菸草幼苗，獲得具有含氯黴素乙醯轉移酶基因的重組衛星RNA的CMV侵染的菸草，用顯症菸草的葉汁液再接種3～7葉期的菸草幼苗，2-4天後在所有接種植株上均檢測到氯黴素乙醯轉移酶活性。
實施例8以衛星RNA為模板通過逆轉錄和PCR方法克隆衛星RNA的全長cDNA，在cDNA的96-183位鹼基之間用替換方式插入螢光素酶基因(1649bp)獲得全長為1912bp的重組衛星DNA，再將重組衛星DNA組裝到PCASS2質粒的35S啟動子的下遊從而獲得含重組衛星DNA的PCASS2質粒，以含重組衛星DNA的PCASS2質粒和不含衛星RNA的CMV共同接種菸草，在CMV的存在下轉錄獲得具有含螢光素酶基因的重組衛星RNA，用具有含螢光素酶基因的重組衛星RNA的CMV擴大接種感染菸草，根據植株中螢光素活性判斷，陽性株率55％以上。
實施例9根據CMV中的衛星RNA的cDNA的5』端116個鹼基、胰島素原類似物基因(其DNA長度為30bp、胺基酸序列為Arg-Arg-Gly-Ser-Arg-Lys)的序列和3』端218個鹼基的序列，用DNA合成儀人工全合成一個364個鹼基的重組衛星DNA；並組裝到RNA體外轉錄試劑盒中外源DNA載體的SP6啟動子的下遊，通過用體外轉錄試劑盒轉錄獲得含胰島素原類似物基因的重組衛星RNA，後者與不含衛星RNA的CMV共同接種無病毒馬鈴薯幼苗，並在80％以上的馬鈴薯薯塊中檢測到胰島素原類似物。
權利要求
1.一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於它以黃瓜花葉病毒(CMV，下同)的衛星RNA作為表達載體，通過構建含外源基因的重組衛星RNA，然後將含外源基因的重組衛星RNA與CMV共同接種植物並表達外源基因，或共同接種植物細胞培養物，並在組織培養條件下表達外源基因；所述含外源基因的重組衛星RNA是指含有一種外源基因的衛星RNA序列，其外源基因的長度為30bp～1800bp，或含有以串聯方式連接的兩種或兩種以上外源基因的衛星RNA序列，其外源基因的總長度為60bp～1800bp。
2.如權利要求1所述的一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於所述的含外源基因的重組衛星RNA的構建。是指以衛星RNA為模板通過逆轉錄和PCR獲得其cDNA，在cDNA上以替換或插入的方式組裝外源基因，獲得重組衛星DNA，並將重組衛星DNA組裝到轉錄載體上然後在CMV的存在下轉錄，或將重組衛星DNA進行體外轉錄，獲得具有含外源基因的重組衛星RNA。
3.如權利要求1所述的一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於所述的含外源基因的重組衛星RNA的構建是指通過根據衛星RNA的序列，用DNA合成儀人工合成包含衛星RNA兩端序列的PCR引物，然後用PCR方法克隆外源基因獲得重組衛星DNA，並將其組裝到轉錄載體上然後在CMV的存在下轉錄，或將重組衛星DNA進行體外轉錄，獲得具有含外源基因的重組衛星RNA。
4.如權利要求1所述的一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於所述的含外源基因的重組衛星RNA的構建是指通過根據衛星RNA兩端序列和外源基因的序列，用DNA合成儀人工全合成重組衛星DNA，並將重組衛星DNA組裝到轉錄載體上然後在CMV的存在下轉錄，或將重組衛星DNA進行體外轉錄，獲得具有含外源基因的重組衛星RNA。
5.如權利要求1所述的一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於所述的外源基因的長度的優選範圍為30bp～300bp。
6.如權利要求1所述的一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，其特徵在於所述的外源基因的長度的最優範圍為50bp～150bp。
7.如權利要求1所述的一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法，所述的CMV可以含有衛星RNA或不含衛星RNA。
全文摘要
本發明提供了一種以植物為生物反應器表達外源基因的方法,它以黃瓜花葉病毒(CMV)的衛星RNA作為表達載體,通過構建含外源基因的重組衛星RNA,接種植物並表達外源基因,或接種植物細胞培養物並在組織培養條件下表達外源基因。本發明不會破壞CMV複製體系的完整性,通過在衛星RNA上裝載不同的目的基因並接種侵染不同植物,可持續高效表達不同的基因工程蛋白質,其表達量大大高於已有表達系統。
文檔編號C12N15/83GK1247231SQ9811892
公開日2000年3月15日 申請日期1998年9月8日 優先權日1998年9月8日
發明者陳集雙, 張耀洲, 馮明光, 柴立紅 申請人:陳集雙