一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素b分離提取方法
2023-05-18 02:56:01 1
一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素b分離提取方法
【專利摘要】本發明公開了一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其步驟是發酵液經大孔樹脂吸附，乙酸乙酯解析後，得粗品；粗品首先經微濾膜、超濾膜除去大分子等雜質；再將上述濾液經過埃博黴素B分子印跡聚合物膜過濾得到純的埃博黴素B液體；最後經過結晶得到埃博黴素B。本發明便於連續操作、易於放大、操作簡單、成本低、選擇性高，可快速地將埃博黴素B分子從其結構類似物的混合物中分離出來，易於實現工業化生產。
【專利說明】一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法
【技術領域】
[0001]本發明屬於抗生素分離提取領域，具體地涉及到一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法。
【背景技術】
[0002]埃博黴素B(Epothilone B)是微生物纖維堆囊菌產生的一類大環內酯類次級代謝產物。1994年美國國家癌症學會發現埃博黴素B對腫瘤細胞具有抑制活性，Merck實驗室發現它和紫彬醇至少在微管蛋白聚合實驗中具有相同作用，證明了埃博黴素對腫瘤細胞有抑制作用的事實，進一步的研究發現埃博黴素具有比紫彬醇優越的抗腫瘤特性，使得研究者把更多的精力投入到對其合成及分離提取上，以期更快的將其開發成為抗腫瘤藥物。但是目前公開發表的分離提取埃博黴素B方法步驟繁瑣，生產成本高，尚需研究大規模和簡單廉價是分離純化方法。
[0003]分子印跡技術以其預定性、識別性和實用性三大特點引起科學界廣泛關注。將分子印跡技術與膜分離技術結合起來，製成的分子印跡聚合物膜(Molecular ImprintedMembrane, MIM),兼具分子印跡技術與膜分離技術的優點，一方面,該技術具有便於連續操作、易於放大、能耗低、能量利用率高等優點，被看作是一種「綠色化學」的典型；另一方面，與傳統的分子印跡微球材料相比，分子印跡聚合物膜具有材料更穩定，不需研磨等繁瑣的製備過程，擴散阻力小， 易於應用等獨特的優點；另外，與目前商售膜如超濾、微濾及反滲透膜等無法實現單個物質的選擇性分離的缺點相比，分子印跡膜的最大特點就是對模板分子的識別具有可預見性，針對性及高度選擇性，為將特定目標分子從其結構類似物的混合物中分離出來提供了可行且有效的解決途徑。分子印跡膜鑑於以上特點，將其應用到埃博黴素B的分離提取中將具有十分誘人的前景。
[0004]經過檢索，目前還沒有將分子印跡聚合物膜應用到埃博黴素B的分離純化過程中的相關報導。
【發明內容】
[0005]針對現有技術的不足，本發明的目的是提供一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其操作簡便，選擇性高，極大地降低了提純成本。
[0006]為實現上述目的，本發明採用如下的技術方案:
[0007](I)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基中加入經過處理的大孔樹脂，發酵結束後，過濾得到吸附樹脂；其中，大孔樹脂的加入量為液體培養基體積的2-5% ；
[0008](2)乙酸乙酯浸提:用乙酸乙酯浸提吸附樹脂，收集浸提液；
[0009](3)浸提液的初步過濾:將浸提液首先通過孔徑為0.2-0.5um的微濾膜過濾，除去殘留的菌體，得到濾液；再將濾液採用截留分子量為1000-5000的超濾膜過濾以去除大分子雜質，收集濾液，得到粗提物；[0010](4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:首先將博黴素B分子印跡聚合物膜固定在透過裝置的原料池和透過池之間，向原料池中加入粗提物，透過池中加入乙酸乙酯，將透過裝置密封，攪拌下進行15_30min後，收集透過液得到埃博黴素B溶液；
[0011](5)結晶:將埃博黴素B溶液進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液於-20~-10°C下進行結晶，得到白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。
[0012]所述的步驟(1)中的液體培養基成分為土豆澱粉2.5~3.0g/L，蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖 0.2 ~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η20 2.3 ~2.5g/L, CaCl23.0 ~
3.5g/L, EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L，pH 值為 7.2 ;發酵的時間為 120_150h。
[0013]所述步驟(1)中纖維堆囊菌菌株號為ATCC25532或ATCC25569。
[0014]所述步驟(1)中大孔樹脂的採用如下方法進行處理:首先，用3~5倍大孔樹脂體積的甲醇浸泡大孔樹脂，搖床震蕩12-16h後，去除甲醇溶液，水洗至無甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h後，水洗至無甲醇味；大孔樹脂為XAD-16型大孔樹脂。
[0015]所述步驟(2)中乙酸乙酯的用量為大孔樹脂體積的3~5倍，浸提的時間為24-48h。
[0016]所述步驟(3)中微濾膜與超濾膜的材質均為醋酸纖維素、聚碸、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚醯胺。
[0017]所述步驟(3)中微濾膜過濾的操作壓力為0.1-0.5Mpa，操作溫度為0_40°C，控制流速5-10mL/min ;超濾 膜過濾的操作壓力為0.1-0.6MPa，溫度0_40°C，控制流速5_10mL/min0
[0018]所述的埃博黴素B分子印跡聚合物膜是採用如下方法得到的:將埃博黴素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比1:4:20混合均勻後，溶解於體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，攪拌均勻加入偶氮二異丁氰，充N2反應12h ;然後將尼龍微孔濾膜浸泡20min後取出放入兩個玻璃片之間，在波長為365nm、功率為400W的紫外燈下照射IOh後，將玻璃片分開，用乙酸:甲醇體積比為1:9的溶液清洗掉埃博黴素B，即得到以尼龍微孔濾膜為支撐材料的埃博黴素B分子印跡聚合物膜；其中，所述體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量為20~25mL/lmmol埃博黴素B ;偶氮二異丁腈與埃博黴素B的比為5mg:Imol ο
[0019]所述步驟(4)埃博黴素B分子印跡膜過濾的具體過程如下:透過裝置為H型透過裝置，包括兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的原料池和透過池，原料池和透過池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜固定，保持原料池和透過池底部連通，H型透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm，原料池中加入粗提物250mL，透過池中加入乙酸乙酯250mL，將透過裝置密封，在攪拌下進行15-30min後，收集透過液即得到埃博黴素B溶液。
[0020]所述步驟(5)中濃縮的溫度為40~45°C，真空度為-0.085~-0.09MPa。
[0021]與現有技術相比，本發明具有以下有益效果:本發明一方面採用膜過濾技術初步分離埃博黴素B，可以有效地去除一些大分子物質，並且具有操作簡便，選擇性好，低汙染等特點。本發明另一方面將濾液滲透過分子印跡聚合物膜的方法，不僅是因為埃博黴素B分子印跡聚合物膜具有與埃博黴素B分子相匹配的孔穴，這些孔穴具有高度的選擇性及專一識別性，只能夠使埃博黴素B快速順利地通過孔道，而限制了其他分子的透過，最終得到純淨的埃博黴素B溶液；而且分子印跡膜在分離方面有著色譜分離所不具備的優勢，它可以進行連續的分離，兩且分離物的量也不受限制，簡化了分離步驟，便於工業化大生產，具有很好的應用前景。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022]圖1為本發明中H型透過裝置的結構示意圖。
[0023]其中，I為原料池，2為透過池，3為埃博黴素B分子印跡聚合物膜。
【具體實施方式】
[0024]下面結合附圖和具體的實施例對本發明做進一步的詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限定。
[0025]實施例1
[0026](I)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基中加入經過處理的大孔樹脂XAD-16，大孔樹脂XAD-16存在於整個發酵流程之中，發酵120h後過濾得到吸附樹脂；
[0027]其中，大孔樹脂XAD-16的加入量為液體培養基體積的2% ；
[0028]大孔樹脂X AD-16的採用如下方法進行處理:首先,用3倍大孔樹脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹脂XAD-16，搖床震蕩12h後，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹脂XAD-16至無甲醇味；再用甲醇浸泡12h後,純水洗至無甲醇味；
[0029]液體培養基成分為土豆澱粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4 ? 7H20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0030](2)乙酸乙酯浸提:用4倍樹脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹脂24h，收集浸提液，得埃博黴素B的粗提物。
[0031](3)用超濾膜過濾浸提液:
[0032]將埃博黴素B的粗提物首先通過孔徑為0.2-0.5um的醋酸纖維素材質的微濾膜過濾，除去殘留的菌體，並用50mL的乙酸乙酯洗濾I次，合併濾液；其中，微濾膜過濾操作壓力為0.2Mpa，操作溫度為20°C，控制流速5mL/min。
[0033]再將合併後的濾液用超濾膜進一步過濾:採用截留分子量為1000的醋酸纖維素材質的超濾膜過濾，去除大分子雜質，並用50mL的乙酸乙酯洗濾I次，合併濾液，得粗提物；其中，超濾膜過濾的操作壓力為0.2MPa，溫度20°C，控制流速5mL/min。
[0034](4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:參見圖1，首先取兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個為原料池1，另一個為透過池2，於兩個玻璃池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒有滲漏，組成密封H型透過裝置，透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池I中加入上述濾液250mL，向透過池2中加入乙酸乙酯純溶劑250mL，將透過裝置密封，在電磁攪拌下進行15min後，再將埃博黴素B分子印跡聚合物膜取出，用50mL乙酸乙酯洗脫I次得洗脫液，將透過液與洗脫液合併即為埃博黴素B溶液。
[0035]所述的埃博黴素B分子印跡聚合物膜是採用如下方法得到的:將埃博黴素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比1:4:20混合均勻後，溶解於體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，攪拌均勻加入偶氮二異丁氰，充N2反應12h ;然後將尼龍微孔濾膜放入混合液中浸泡20min ;取出尼龍微孔濾膜置於兩個玻璃片之間，在波長為365nm、功率為400W的紫外燈下照射IOh後，將玻璃片分開，用乙酸:甲醇體積比為1:9的溶液清洗掉埃博黴素B，即得到以尼龍微孔濾膜為支撐材料的埃博黴素B分子印跡聚合物膜；其中，所述體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量為20~25mL/lmmol埃博黴素B ;偶氮二異丁腈與埃博黴素B的比為5mg: Imol ο
[0036](5)結晶:將埃博黴素B溶液在溫度為40°C、真空度為-0.085MPa下進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔淨的結晶器中-20°C低溫結晶，在結晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。
[0037]實施例2
[0038](I)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25569在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基中加入經過處理的大孔樹脂XAD-16，大孔樹脂XAD-16存在於整個發酵流程之中，發酵150h後過濾得到吸附樹脂。
[0039]其中，大孔樹脂XAD-16的加入量為液體培養基體積的3% ；
[0040]大孔樹脂XAD-16的採用如下方法進行處理:首先,用3倍大孔樹脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹脂XAD-16，搖床震蕩12h後，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹脂XAD-16至無甲醇味；再用甲醇浸泡12h後,純水洗至無甲醇味；
[0041]液體培養基成分為土豆澱 粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0042](2)乙酸乙酯浸提:用3倍樹脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹脂36h，收集浸提液，得埃博黴素B的粗提物。
[0043](3)用超濾膜過濾浸提液:
[0044]將埃博黴素B的粗提物首先通過孔徑為0.2-0.5um的聚丙烯材質的微濾膜過濾，除去殘留的菌體,並用乙酸乙酯洗濾2次，每次50mL，合併濾液；其中，微濾膜過濾操作壓力為0.4Mpa，操作溫度為30°C，控制流速8mL/min。
[0045]再將合併後的濾液用超濾膜進一步過濾:採用截留分子量為2000的聚丙烯材質的超濾膜過濾，去除大分子雜質，並用乙酸乙酯洗濾2次，每次50mL，合併濾液，得粗提物；其中，超濾膜過濾的操作壓力為0.5MPa，溫度30°C，控制流速8mL/min。
[0046](4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:首先取兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個為原料池1，另一個為透過池2，於兩個玻璃池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜固定，保持底部連通，保證兩池沒有滲漏，組成密封H型透過裝置，透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池I中加入上述濾液250mL，向透過池2中加入乙酸乙酯純溶劑250mL，將透過裝置密封，在電磁攪拌下進行25min後，再將埃博黴素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫2次，每次50mL，得洗脫液，將透過液與洗脫液合併即為埃博黴素B溶液。
[0047]本實施例中的埃博黴素B分子印跡聚合物膜的製備方法同實施例1。
[0048](5)結晶:將埃博黴素B溶液在溫度為42°C、真空度為_0.088MPa下進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔淨的結晶器中-20°C低溫結晶，在結晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。
[0049]實施例3
[0050](I)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基加入經過處理的大孔樹脂XAD-16，大孔樹脂XAD-16存在於整個發酵流程之中，發酵130h後過濾得到吸附樹脂；
[0051 ] 其中，大孔樹脂XAD-16的加入量為液體培養基體積的5% ；
[0052]大孔樹脂XAD-16的採用如下方法進行處理:首先，用3倍大孔樹脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹脂XAD-16，搖床震蕩12h後，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹脂XAD-16至無甲醇味；再用甲醇浸泡12h後,純水洗至無甲醇味；
[0053]液體培養基成分為土豆澱粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7Η20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0054](2)乙酸乙酯浸提:用5倍樹脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹脂48h，收集浸提液，得埃博黴素B的粗提物。
[0055](3)用超濾膜過濾浸提液:將埃博黴素B的粗提物首先通過孔徑為0.2-0.5um的聚乙烯腈材質的微濾膜過濾，除去殘留的菌體,並用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合併濾液；其中，微濾膜過濾操作壓力 為0.5Mpa，操作溫度為40°C，控制流速10mL/min。
[0056]再將合併後的濾液用超濾膜進一步過濾:採用截留分子量為3000的聚乙烯腈材質的超濾膜過濾，去除大分子雜質，並用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合併濾液，得粗提物；其中，超濾操作壓力為0.6MPa，溫度40°C，控制流速10mL/min。
[0057](4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:首先取兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個為原料池1，另一個為透過池2，於兩個玻璃池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒有滲漏，組成密封H型透過裝置，透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm，一池中加入上述濾液250mL，另一池中加入乙酸乙酯純溶劑250mL，將透過裝置密封，在電磁攪拌下進行30min後，再將埃博黴素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫3次，每次50mL，將透過液與洗脫液合併即為埃博黴素B溶液。
[0058]本實施例中的埃博黴素B分子印跡聚合物膜的製備方法同實施例1。
[0059](5)結晶:將埃博黴素B溶液在溫度為45°C、真空度為_0.09MPa下進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔淨的結晶器中-20°C低溫結晶，在結晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。
[0060]實施例4
[0061](I)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基加入經過處理的大孔樹脂XAD-16，大孔樹脂XAD-16存在於整個發酵流程之中，發酵140h後過濾得到吸附樹脂；
[0062]其中，大孔樹脂XAD-16的加入量為液體培養基體積的4% ；
[0063]大孔樹脂XAD-16的採用如下方法進行處理:首先，用5倍大孔樹脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹脂XAD-16，搖床震蕩14h後，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹脂XAD-16至無甲醇味；再用甲醇浸泡16h後,純水洗至無甲醇味；
[0064]液體培養基成分為土豆澱粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4 ? 7H20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0065](2)乙酸乙酯浸提:用3倍樹脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹脂30h，收集浸提液，得埃博黴素B的粗提物。
[0066](3)用超濾膜過濾浸提液:將埃博黴素B的粗提物首先通過孔徑為0.2-0.5um的聚乙烯醇材質的微濾膜過濾，除去殘留的菌體,並用50mL的乙酸乙酯洗濾3次，合併濾液；其中，微濾膜過濾操作壓力為0.1Mpa,操作溫度為10°C,控制流速6mL/min。
[0067]再將合併後的濾液用超濾膜進一步過濾:採用截留分子量為4000的聚乙烯醇材質的超濾膜過濾，去除大分子雜質，並用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合併濾液，得粗提物；其中，超濾操作壓力為0.1MPa，溫度0°C，控制流速7mL/min。 [0068](4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:首先取兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個為原料池1，另一個為透過池2，於兩個玻璃池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒有滲漏，組成密封H型透過裝置，透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池中加入上述濾液(即粗提物)250mL,向透過池中加入乙酸乙酯純溶劑250mL，將透過裝置密封，在電磁攪拌下進行20min後，再將埃博黴素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫3次，每次50mL，將透過液與洗脫液合併即為埃博黴素B溶液。
[0069]本實施例中的埃博黴素B分子印跡聚合物膜的製備方法同實施例1。
[0070](5)結晶:將埃博黴素B溶液在溫度為41°C、真空度為-0.09MPa下進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔淨的結晶器中-20°C低溫結晶，在結晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。
[0071]實施例5
[0072](I)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌ATCC25532在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基加入經過處理的大孔樹脂XAD-16，大孔樹脂XAD-16存在於整個發酵流程之中，發酵125h後過濾得到吸附樹脂；
[0073]其中，大孔樹脂XAD-16的加入量為液體培養基體積的2% ；
[0074]大孔樹脂XAD-16的採用如下方法進行處理:首先，用4倍大孔樹脂XAD-16體積的甲醇浸泡大孔樹脂XAD-16，搖床震蕩16h後，去除甲醇溶液，純水洗大孔樹脂XAD-16至無甲醇味；再用甲醇浸泡14h後,純水洗至無甲醇味；
[0075]液體培養基成分為土豆澱粉2.5~3.0g/L,蔗糖0.7~1.0g/L,葡萄糖0.2~0.5g/L,豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4 ? 7H20 2.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L, pH 值為 7.2。
[0076](2)乙酸乙酯浸提:用5倍樹脂體積的乙酸乙酯浸提吸附樹脂40h，收集浸提液，得埃博黴素B的粗提物。
[0077](3)用超濾膜過濾浸提液:將埃博黴素B的粗提物首先通過孔徑為0.2-0.5um的聚碸材質的微濾膜過濾，除去殘留的菌體,並用乙酸乙酯洗濾2次，每次50mL，合併濾液；其中，微濾膜過濾操作壓力為0.5Mpa，操作溫度為40°C，控制流速10mL/min。
[0078]再將合併後的濾液用超濾膜進一步過濾:採用截留分子量為3000的聚碸材質的超濾膜過濾，去除大分子雜質，並用乙酸乙酯洗濾3次，每次50mL，合併濾液，得粗提物；其中，超濾操作壓力為0.6MPa，溫度40°C，控制流速10mL/min。
[0079](4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:首先取兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的玻璃池，一個為原料池1，另一個為透過池2，於兩個玻璃池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜3固定，保持底部連通，保證兩池沒有滲漏，組成密封H型透過裝置，透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm,向原料池I中加入上述濾液250mL，向透過池2中加入乙酸乙酯純溶劑250mL，將透過裝置密封，在電磁攪拌下進行30min後，再將埃博黴素B分子印跡聚合物膜取出，用乙酸乙酯洗脫3次，每次50mL，將透過液與洗脫液合併即為埃博黴素B溶液。
[0080]本實施例中的埃博黴素B分子印跡聚合物膜的製備方法同實施例1。
[0081](5)結晶:將埃博黴素B溶液在溫度為45°C、真空度為-0.09MPa下進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液放入潔淨的結晶器中-20°C低溫結晶，在結晶皿底部可獲得大量的白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。
[0082]本發明提供了一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其步驟是發酵液經大孔樹脂吸附，乙酸乙酯解析後，得粗品；粗品首先經微濾膜、超濾膜除去大分子等雜質；再將上述濾液經過埃博黴素B分子印跡聚合物膜過濾得到純的埃博黴素B液體；最後經過結晶得到埃博黴素B的晶體。本發明具有以下優點:便於連續操作、易於放大、操作簡單、成本低、選擇性高，可快速地將埃博黴素B分子從其結構類似物的混合物中分離出來，易於實現工業化生產，具有十分誘人的前景。
[0083]本發明所提供的分子印跡膜的方法便於連續操作、易於放大，並且具有可預見性，針對性及高度選擇性等特點，實現了特定的目標分子從其結構類似物的混合物中分離出來的目的。`
【權利要求】
1.一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，包括以下步驟: (1)樹脂對發酵液進行吸附:將纖維堆囊菌在液體培養基中進行發酵，並向液體培養基中加入經過處理的大孔樹脂，發酵結束後，過濾得到吸附樹脂；其中，大孔樹脂的加入量為液體培養基體積的2-5% ； (2)乙酸乙酯浸提:用乙酸乙酯浸提吸附樹脂，收集浸提液； (3)浸提液的初步過濾:將浸提液首先通過孔徑為0.2-0.5um的微濾膜過濾，除去殘留的菌體，得到濾液；再將濾液採用截留分子量為1000-5000的超濾膜過濾以去除大分子雜質，收集濾液，得到粗提物； (4)埃博黴素B分子印跡膜過濾:首先將博黴素B分子印跡聚合物膜固定在透過裝置的原料池和透過池之間，向原料池中加入粗提物，透過池中加入乙酸乙酯，將透過裝置密封，攪拌下進行15-30min後，收集透過液得到埃博黴素B溶液； (5)結晶:將埃博黴素B溶液進行真空濃縮，得到濃縮液，再將濃縮液於-20~-10°C下進行結晶，得到白色粉末狀結晶，即為埃博黴素B。`
2.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述的步驟(1)中的液體培養基成分為土豆澱粉2.5~3.0g/L，蔗糖0.7~1.0g/L，葡萄糖 0.2 ~0.5g/L，豆餅粉 1.7 ~2.0g/L, MgSO4.7H202.3 ~2.5g/L, CaCl2 3.0 ~3.5g/L, EDTA-Fe3+ 2mL/L，微量元素 0.5 ~1.0mL/L，pH 值為 7.2 ;發酵的時間為 120_150h。
3.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述步驟(1)中纖維堆囊菌菌株號為ATCC25532或ATCC25569。
4.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述的步驟(1)中大孔樹脂的採用如下方法進行處理:首先，用3~5倍大孔樹脂體積的甲醇浸泡大孔樹脂，搖床震蕩12-16h後，去除甲醇溶液，水洗至無甲醇味；再用甲醇浸泡12-16h後，水洗至無甲醇味；大孔樹脂為XAD-16型大孔樹脂。
5.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述步驟(2)中乙酸乙酯的用量為大孔樹脂體積的3~5倍，浸提的時間為24-48h。
6.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述步驟(3)中微濾膜與超濾膜的材質均為醋酸纖維素、聚碸、聚丙烯、聚丙烯腈、聚乙烯醇或聚醯胺。
7.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述步驟(3)中微濾膜過濾的操作壓力為0.1-0.5Mpa，操作溫度為0-40°C，控制流速5-10mL/min ;超濾膜過濾的操作壓力為0.1-0.6MPa，溫度0_40°C，控制流速5_10mL/min。
8.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述的埃博黴素B分子印跡聚合物膜是採用如下方法得到的:將埃博黴素B、甲基丙烯酸、乙二醇二甲基丙烯酸酯按照摩爾比1:4:20混合均勻後，溶解於體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液中，攪拌均勻加入偶氮二異丁氰，充N2反應12h ;然後將尼龍微孔濾膜浸泡20min後取出放入兩個玻璃片之間，在波長為365nm、功率為400W的紫外燈下照射IOh後，將玻璃片分開，用乙酸:甲醇體積比為1:9的溶液清洗掉埃博黴素B，即得到以尼龍微孔濾膜為支撐材料的埃博黴素B分子印跡聚合物膜；其中，所述體積比為4:1的乙醇和甲醇的混合溶液的用量為20~25mL/lmmol埃博黴素B ;偶氮二異丁腈與埃博黴素B的比為5mg:1mol ο
9.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述步驟(4)埃博黴素B分子印跡膜過濾的具體過程如下:透過裝置為H型透過裝置，包括兩個完全相同的500mL帶有磨口支管的原料池和透過池，原料池和透過池中間用夾子將埃博黴素B分子印跡聚合物膜固定，保持原料池和透過池底部連通，H型透過裝置中的滲透橫截面的有效直徑為5.5cm，原料池中加入粗提物250mL，透過池中加入乙酸乙酯250mL，將透過裝置密封，在攪拌下進行15-30min後，收集透過液即得到埃博黴素B溶液。
10.根據權利要求1所述的一種基於分子印跡膜過濾技術的埃博黴素B分離提取方法，其特徵在於，所述`步驟(5)中濃縮的溫度為40~45°C，真空度為-0.085~-0.09MPa。
【文檔編號】C07D493/04GK103772406SQ201410032060
【公開日】2014年5月7日 申請日期:2014年1月23日 優先權日:2014年1月23日
【發明者】龔國利, 趙婷峰 申請人:陝西科技大學