雙酶水解法製備高F值寡肽粗液的製作方法

2023-05-08 23:09:11

本發明涉及活性肽製備技術領域，具體是一種雙酶水解法製備高f值寡肽粗液。

背景技術：

帶魚（largeheadhairtail），別稱刀魚、牙帶魚，屬於脊索動物門、鱸形目，體型呈帶狀。主要分布於西太平洋和印度洋，在中國的黃海、東海、渤海一直到南海都有分布，和大黃魚、小黃魚及烏賊並稱為中國的四大海產。

2014年度，舟山市帶魚捕獲量達到108104噸，佔主要漁獲品種的比例達到11.52%。舟山帶魚多以新鮮或加工成各種魚製品出售，然而帶魚的開發利用依然處於粗加工階段，高附加值的利用程度較低。

帶魚的平均蛋白含量達到18.4%以上，這使得它成為豐富的蛋白質原材料來源。蛋白質經過酶解等特殊處理，可以製備具備一些特殊生理、保健等功能的生物活性肽。目前，我國對帶魚蛋白的研究雖然取得了一些進展，但是還未能開發出高活性的蛋白，還未能更佳充分地開發利用帶魚資源。因此，對帶魚蛋白的深入研究，開發出具備高附加值的帶魚蛋白產品成為迫在眉睫的問題。

高f值寡肽是一類由2-9個胺基酸以獨特的方式組合成的小肽混合物，其主要特徵是胺基酸混合物中支鏈胺基酸與芳香族胺基酸比值遠高於人體模式。支鏈胺基酸中的纈氨酸（val）異亮氨酸（ile）亮氨酸（leu）具有維護神經系統正常、增加食慾、治療貧血、促進傷口痊癒等特殊的生理功能。在臨床上，高f值寡肽常用來用來治療肝性腦病，苯丙酮尿症，改善病人術後的營養狀況等。近年來，國內高f值寡肽開發方面成為功能食品的研究熱點。如以大豆、玉米、花生等植物為原料，以金槍魚、魷魚、牡蠣等水產品為原料製備的高f值寡肽。目前對於帶魚高f值寡肽的開發研究僅處在實驗室水平的探索，市面上的製成品寥寥無幾。

目前，較為流行和科學的製備高f值寡肽方法是採用雙酶分布酶解法。其主要工藝是首先通過酶解使蛋白肽鏈的芳香族胺基酸殘基位點暴露出來，然後用某些特定蛋白酶酶解切掉芳香族胺基酸，使之以游離態存在於溶液中，再用其他方法最大化去除芳香族胺基酸。製備高f寡肽的關鍵是儘可能的保留支鏈胺基酸（val、ile、leu簡稱bcaa），去除芳香族胺基酸（tyr、phe，簡稱aaa），達到bcaa/aaa的摩爾濃度比大於20。

現有技術如授權公告號為cn104004087b的中國發明專利，公開了一種水蛭高f值寡肽及其酶解製備方法與應用，製備方法包括：（1）水蛭幹體初步清洗除雜，高速粉碎；（2）原料鹼預浸泡；（3）鹼性蛋白酶alcalaseaf2.4l結合木瓜蛋白酶雙酶水解；（4）採用活性炭粉靜態吸附脫除芳香族胺基酸；（5）以凝膠過濾層析柱進一步分離純化，收集分離產物，冷凍乾燥，獲得分子量低於2000da，f值（fischerratio，即支鏈胺基酸與芳香族胺基酸摩爾含量的比值）高於20的水蛭寡肽粉。該方法製備過程簡單，選用鹼性蛋白酶和木瓜蛋白酶兩種商業用酶，易於工業生產，產率較高，具有一定的抗凝血效果，並為高f值類產品增加了新來源。該方法酶水解後蛋白轉化率不是很理想，f值有待提高。

技術實現要素：

本發明的目的在於提供一種採用雙酶水解法製備芳香族胺基酸殘基暴露率高，酶特異性切除芳香族胺基酸率高，f值高的粗肽液。

針對背景技術中提到的問題，採取的技術方案為：

雙酶水解法製備高f值寡肽粗液，具體步驟為：

預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水衝洗乾淨，剪成小塊；

去腥：在步驟1處理好的帶魚中按體積比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素e。浸泡，浸泡時間為4~8h。帶魚身上的腥味物質特徵成分是三甲胺，上述去腥液既能與三甲胺反應形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；

脫脂：將去腥後的帶魚搗碎，過篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，去除油脂，過濾，在42~48℃環境下烘乾，得到去脂帶魚粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導致酶解液的色澤、氣味的變化；其次，脂肪與蛋白乳化造成水解後的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利製備的重要條件。採用上述方法脫脂，脫脂率高達92%以上；

酶解：在帶魚粉末中按體積比1:4.6~5.3加入蒸餾水，調節ph，加入胃蛋白酶和酶激活劑，胃蛋白酶酶激活劑成份及其重量份為：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份維生素b1。上述酶激活劑能激活胃蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，縮短寡肽粗液製備時間。胃蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為1.5~2.3，酶解溫度為35-37℃，酶解時間為1.8~2.6h。胃蛋白酶屬於天冬氨酸蛋白酶，它傾向於剪切氨基端或羧基端為芳香族胺基酸，芳香族胺基酸殘基暴露率高，利於第二步外切酶特異性切除。酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，調節ph，加入風味蛋白酶和酶激活劑，風味酶酶激活劑成份及其重量份為：0.03~0.05份醋酸鎂和0.001~0.003份碳酸二甲酯。上述酶激活劑能激活風味蛋白酶活性。風味蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為6.4~7.2，酶解溫度為48~52℃，酶解時間為1.2~1.9h。風味蛋白酶天然安全，可應用於各種動植物蛋白的水解，後期風味優化。由於第一步內切酶解後，生成了一些短鏈肽，而其中的一些含有疏水胺基酸，具有苦感。而利用風味酶作為外切酶恰好可以將苦肽降解為胺基酸。並且通過末端水解多肽，提高水解度。風味酶作為內切酶將芳香族胺基酸從多肽鏈上切除，提高了寡肽的f值。因此，利用風味酶不僅可以去除苦味，改善口感，製取風味良好的動植物水解產品，提高產品質量，而且還能降低生產成本，這符合工業化生產的必要條件。風味蛋白酶酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，過濾得到高f值寡肽粗液。高f值寡肽粗液中含有胺基酸序列為hshactsy的高f值寡肽。

與現有技術相比，本發明的優點在於：帶魚身上的腥味物質特徵成分是三甲胺，本發明的去腥液既能與三甲胺反應形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；採用乙酸乙酯脫脂，脫脂率高；胃蛋白酶酶激活劑和風味蛋白酶酶激活劑分別能激活胃蛋白酶和風味蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，縮短寡肽粗液製備時間；胃蛋白酶屬於天冬氨酸蛋白酶，它傾向於剪切氨基端或羧基端為芳香族胺基酸，芳香族胺基酸殘基暴露率高，利於第二步外切酶特異性切除；風味蛋白酶天然安全，可應用於各種動植物蛋白的水解，後期風味優化。由於第一步內切酶解後，生成了一些短鏈肽，而其中的一些含有疏水胺基酸，具有苦感。而利用風味酶作為外切酶恰好可以將苦肽降解為胺基酸。並且通過末端水解多肽，提高水解度。風味酶作為內切酶將芳香族胺基酸從多肽鏈上切除，提高了寡肽的f值。因此，利用風味酶不僅可以去除苦味，改善口感，製取風味良好的動植物水解產品，提高產品質量，而且還能降低生產成本，這符合工業化生產的必要條件。

具體實施例

下面通過實施例對本發明方案作進一步說明：

實施例1：

雙酶水解法製備高f值寡肽粗液，具體步驟為：

1）預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水衝洗乾淨，剪成小塊；

2）去腥：在步驟1處理好的帶魚中按體積比1:4~8加入去腥液，去腥液成份及其重量份為：5~10份檸檬酸、10~18份紫蘇提取物、0.1~0.3份氯化鈉、0.5~0.8份碳酸氫鈉、0.001~0.003份烏索酸、20~30份乙醇、0.02~0.04份山柰甙和0.2~0.4份維生素e。浸泡，浸泡時間為4~8h。帶魚身上的腥味物質特徵成分是三甲胺，上述去腥液既能與三甲胺反應形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；

3）脫脂：將去腥後的帶魚搗碎，過篩，按體積比1:4.5~5.2加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為20~25h。過濾，濾渣中按體積比1:2~4加入去離子水，去除油脂，過濾，在42~48℃環境下烘乾，得到去脂帶魚粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導致酶解液的色澤、氣味的變化；其次，脂肪與蛋白乳化造成水解後的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利製備的重要條件。採用上述方法脫脂，脫脂率高達92%以上；

4）酶解：在帶魚粉末中按體積比1:4.6~5.3加入蒸餾水，調節ph，加入胃蛋白酶和酶激活劑，胃蛋白酶酶激活劑成份及其重量份為：0.002~0.004份乙酸丙酯和0.01~0.04份維生素b1。上述酶激活劑能激活胃蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，縮短寡肽粗液製備時間。胃蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為1.5~2.3，酶解溫度為35-37℃，酶解時間為1.8~2.6h。胃蛋白酶屬於天冬氨酸蛋白酶，它傾向於剪切氨基端或羧基端為芳香族胺基酸，芳香族胺基酸殘基暴露率高，利於第二步外切酶特異性切除。酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，調節ph，加入風味蛋白酶和酶激活劑，風味酶酶激活劑成份及其重量份為：0.03~0.05份醋酸鎂和0.001~0.003份碳酸二甲酯。上述酶激活劑能激活風味蛋白酶活性。風味蛋白酶的加酶量為2.8~3.3%，ph為6.4~7.2，酶解溫度為48~52℃，酶解時間為1.2~1.9h。風味蛋白酶天然安全，可應用於各種動植物蛋白的水解，後期風味優化。由於第一步內切酶解後，生成了一些短鏈肽，而其中的一些含有疏水胺基酸，具有苦感。而利用風味酶作為外切酶恰好可以將苦肽降解為胺基酸。並且通過末端水解多肽，提高水解度。風味酶作為內切酶將芳香族胺基酸從多肽鏈上切除，提高了寡肽的f值。因此，利用風味酶不僅可以去除苦味，改善口感，製取風味良好的動植物水解產品，提高產品質量，而且還能降低生產成本，這符合工業化生產的必要條件。風味蛋白酶酶解結束後沸水浴滅酶5~10min，過濾得到高f值寡肽粗液。

實施例2：

雙酶水解法製備高f值寡肽粗液，最優選步驟為：

1）預處理：將帶魚去頭、去皮、去內臟，用清水衝洗乾淨，剪成4cm長小塊；

2）去腥：在步驟1處理好的帶魚中按體積比1:6加入去腥液，去腥液成份及其最優選重量份為：8份檸檬酸、17份紫蘇提取物、0.1份氯化鈉、0.5份碳酸氫鈉、0.001份烏索酸、30份乙醇、0.04份山柰甙和0.3份維生素e。浸泡，浸泡時間為7h。帶魚身上的腥味物質特徵成分是三甲胺，上述去腥液既能與三甲胺反應形成季銨鹽，又能溶解三甲胺，去腥效果十分明顯；

3）脫脂：將去腥後的帶魚搗碎，過40目篩，按體積比1:5加入乙酸乙酯，攪拌，脫脂時間為24h。過濾，濾渣中按體積比1:3加入去離子水，去除油脂，過濾，在45℃環境下烘乾，得到去脂帶魚粉末。脂肪在酶解過程中被氧化，會導致酶解液的色澤、氣味的變化；其次，脂肪與蛋白乳化造成水解後的溶液難分離；因此，對脂肪進行處理是保證蛋白順利製備的重要條件；

4）酶解：在帶魚粉末中按體積比1:5加入蒸餾水，調節ph，加入胃蛋白酶和酶激活劑，胃蛋白酶酶激活劑成份及其重量份為：0.003份乙酸丙酯和0.04份維生素b1。上述酶激活劑能激活胃蛋白酶的活性，使其酶解效率提高，縮短寡肽粗液製備時間。胃蛋白酶的加酶量為3%，ph為2.0，酶解溫度為36℃，酶解時間為2.2h。胃蛋白酶屬於天冬氨酸蛋白酶，它傾向於剪切氨基端或羧基端為芳香族胺基酸，芳香族胺基酸殘基暴露率高，利於第二步外切酶特異性切除。酶解結束後沸水浴滅酶8min，調節ph，加入風味蛋白酶和酶激活劑，風味酶酶激活劑成份及其最優選重量份為：0.05份醋酸鎂和0.001份碳酸二甲酯。上述酶激活劑能激活風味蛋白酶活性。風味蛋白酶的加酶量為3%，ph為7.0，酶解溫度為50℃，酶解時間為1.7h。風味蛋白酶天然安全，可應用於各種動植物蛋白的水解，後期風味優化。由於第一步內切酶解後，生成了一些短鏈肽，而其中的一些含有疏水胺基酸，具有苦感。而利用風味酶作為外切酶恰好可以將苦肽降解為胺基酸。並且通過末端水解多肽，提高水解度。風味酶作為內切酶將芳香族胺基酸從多肽鏈上切除，提高了寡肽的f值。因此，利用風味酶不僅可以去除苦味，改善口感，製取風味良好的動植物水解產品，提高產品質量，而且還能降低生產成本，這符合工業化生產的必要條件。風味蛋白酶酶解結束後沸水浴滅酶8min，過濾得到高f值寡肽粗液。

本發明的操作步驟中的常規操作為本領域技術人員所熟知，在此不進行贅述。

以上所述的實施例對本發明的技術方案進行了詳細說明，應理解的是以上所述僅為本發明的具體實施例，並不用於限制本發明，凡在本發明的原則範圍內所做的任何修改、補充或類似方式替代等，均應包含在本發明的保護範圍之內。

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浙江海洋大學

雙酶水解法製備高f值寡肽粗液

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人工合成

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