茶尺蠖乙醛脫氫酶基因adh及其應用的製作方法
2023-05-09 08:46:31
專利名稱：茶尺蠖乙醛脫氫酶基因adh及其應用的製作方法
技術領域：
本發明屬於昆蟲生物技術領域。具體的說，本發明涉及一種乙醛脫氫酶基因克隆；還涉及利用該基因物進行茶尺蠖等昆蟲抗逆能力評價和昆蟲生長環境監測。
背景技術：
在研究昆蟲生物學等特性的過程中，需要大量的昆蟲材料。從自然界直 接捕捉，費時費力，工效較差。採用人工飼餵方法，可以使昆蟲種群迅速擴 大，但是昆蟲飼養過程中經常出現不明原因的死亡等情況，給昆蟲詞養帶來 損失。醛類是生物體內過氧化反應產物的重要組分，如丙二醛、乙醛等，對生物體有較強的毒害作用。乙醛脫氫酶(aldehyde dehydrogenase, adh)是生物體內用於降解乙醛的重要酶類，它可將乙醛分解為二氧化碳和水，從而消 除醛類對生物細胞的毒害作用。對昆蟲adh基因的克隆和表達研究，有助於 昆蟲飼養過程中非正常死亡原因的探明，同時可利用該基因表達情況的分析 對詞養環境進行評估，從而使昆蟲的人工飼養技術研究更加成熟。 發明內容本發明要解決的技術問題是提供一種茶尺蠖乙醛脫氫酶基因adh及其所 編碼的蛋白質，該adh可用於評價昆蟲的抗逆能力和監測昆蟲的飼養環境。為了解決上述技術問題，本發明提供一種茶尺蠖乙醛脫氫酶基因adh，其 具有SEQIDNo: l所示的核苷酸序列。
本發明還提供了上述基因adh編碼的蛋白質，其具有SEQIDNO: 2所示 的胺基酸序列，這是一種茶尺蠖adh核心區的蛋白質序列。本發明還提供了上述基因adh的用途，可用於評價昆蟲的抗逆能力和監測 昆蟲的飼養環境。作為本發明的基因adh的用途的改進昆蟲為茶尺蠖。本發明主要是針對昆蟲人工詞養過程中出現的不明原因死亡問題，通過 cDNA-AFLP技術研究不同逆境條件下昆蟲基因表達差異，從而獲得與飼養昆 蟲非正常死亡相關的重要基因，即獲得了與茶尺蠖等昆蟲逆境反應有關的基 因；並利用這些基因表達情況進行昆蟲飼養環境的評價。實現本發明的具體技術步驟如下一、茶尺蠖adh基因分離和分析氨和酒精可在茶尺蠖等昆蟲飼養過程中由糞便和殘存食料等發酵形成， 是最常見的飼養環境脅迫因子，因此採用人工配製的氨和酒精混合液模擬環 境脅迫。取茶尺蠖幼蟲若干，將它們分成4組，分別進行不同的氨和酒精混合 液燻蒸處理，包括不燻蒸對照、低劑量燻蒸、中劑量燻蒸和高劑量燻蒸4個處 理。取燻蒸處理0.5-12.0小時後的茶尺蠖若干頭用於cDNA-AFLP分析。上述處 理幼蟲分別置於不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL (Invitrogen公司)試劑提取 總RNA，並以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑盒(上海生工生物工程有限公 司)獲得4種處理幼蟲mRNA。分別取l-5iigmRNA進行cDNA合成，雙鏈cDNA 合成採用TakaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit (寶生物工程(大連)有限公 司)進行。雙鏈cDNA經異丙醇沉澱純化後，以TakaRaBamHI/Hhal (寶生物工 程[大連]有限公司)組合酶切消化。消化後的片段與事先設計的2個接頭SEQ ID No: 3和SEQIDNo: 4，以T4 DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連
接。以連接完成的cDNA片段為模板，以預擴增引物組合SEQIDNo: 5和SEQ ID No: 6進行PCR預擴增，PCR程序見表1第1列，將預擴增產物適當稀釋後， 以選擇性擴增引物組合①SEQIDNo: 7和SEQIDNo: 8，以及組合②SEQID No: 9和SEQIDNo: 10，分別進行PCR選擇性擴增，PCR程序見表1第2列。 擴增產物以6%變性聚丙烯醯胺凝膠進行電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海 生工生物工程有限公司)進行顯帶。1PCR預擴增PCR選擇性擴增PCR常規擴增94。C變性30 秒；56。C退火 60秒;72° C延 伸60秒；共30 個循環。94。C變性30秒；65。C退火30秒；72° C延 伸60秒；l個循環。 94。c變性30秒；65。C退火30秒，並以每 循環下降0.7。C; 72。C延伸60秒;12個循環。 94。C變性30秒；56。C退火30秒；72° C延 伸60秒；23個循環。94。C變性4分鐘； 一個循 環。 94。C變性30秒；55。C退火 30秒；72。C延伸60秒；35個 循環。 72°(:延伸5分鐘。注本發明中未做特別說明的PCR或PCR擴增均指PCR常規擴增從凝膠上割取與脅迫規律相吻合的差異條帶，以純水浸提過夜後，取適 量浸提液作為模板，以選擇性引物組合進行PCR，產物進行電泳。電泳結束後 割取目標條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限 公司)進行片段回收，並插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)， 陽性克隆委託Invitrogen公司進行序列分析。經與美國生物信息資料庫 htt。:〃www.ncbi.nlm.nih.gov比對，確定了其中一個524bp的顯著差異序列是茶 尺蠖adh基因。獲得的adh基因序列，見SEQIDNo: 1。經Editseq軟體(DNAStar 公司)推演，獲得了該基因序列編碼174個胺基酸，見SEQIDNo: 2。序列比 對顯示茶尺蠖adh核苷酸序列與家蠶、海葵等生物具有72%以上的相似性，而 胺基酸序列與家蠶和伊蚊等具有79%-92%的同源性。二、逆境對茶尺蠖內源adh基因表達影響
將茶尺蠖幼蟲分成兩組， 一組在正常溼度條件下飼喂，另一組在高溼度條件下詞喂。處理6-96小時後，在正常溼度和高溼度詞餵組中分別選取幼蟲若 幹頭。以TRIZOL (Invitrogen公司)提取總RNA,以MMLV第一鏈cDNA合成 試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。採用引物組合SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12進行PCR。結果顯示，高溼度環境生長的茶尺蠖幼蟲死亡 率高於正常溼度處理30-60%，同時高溼環境中的茶尺蠖在脅迫初期，幼蟲adh 基因表達顯著高於正常溼度處理，但脅迫處理後期adh表達下降。說明在脅迫 早期昆蟲為了抵禦外界不良環境而提高體內某些抗逆相關基因的表達，以減 少脅迫引起的毒害因子在體內的積累；但是當環境脅迫持續較長時間時，昆 蟲由於積累毒害因子過多而使抗逆能力下降，抗逆基因表達也下降。可見adh 基因表達是一種衡量茶尺蠖等飼養環境好壞的重要指標，通過對該指標的檢 測有助於提高實驗昆蟲飼養成活率。
下面結合附圖對本發明的具體實施方式
作進一步詳細說明。 圖1是實施例1中的擴增產物進行電泳分析後，以核酸銀染試劑盒進行 顯帶所得的圖；注M為DNA分子量標記，1為正常對照，2為低劑量燻蒸處理，3中 劑量燻蒸處理，4為高劑量燻蒸處理。實體黑箭頭所指為分子量標記，白色箭 頭所指為隨脅迫程度表現出先升後降規律的目標條帶。圖2是實施例2中的基因表達圖；注M為DNA分子量標記，1為正常溼度飼餵12小時後茶尺蠖幼蟲，2 為高溼度脅迫12小時後的茶尺蠖幼蟲，3為正常溼度72小時，4為高溼度脅 迫處理72小時。
具體實施方式
實施例l將氨水、工業酒精和水按不同比例勾兌成三種環境脅迫燻蒸液低劑量燻蒸液為包含體積濃度為0.01-0.5%氨水和0.1-0.5%酒精的水溶液，中等劑量燻 蒸液為包含0.6-1.5%氨水和0.5-1%酒精的水溶液，高劑量燻蒸液為包含1.5-6% 氨水和1.1-5%酒精的水溶液。在4個直徑為21cm的培養皿中央分別用膠帶固定 一團脫脂棉球，棉花用量以可以把燻蒸液完全吸持為準，在棉球上分別滴上 三種不同劑量的燻蒸劑，每種用量2-10ml，以滴加相同體積的純水作為對照。 將飼養的40頭3齡茶尺蠖幼蟲平均分成4組，分別置於4個培養皿中，加上適量 茶鮮葉食料後，蓋上培養皿蓋。燻蒸處理6小時後的茶尺蠖用於cDNA-AFLP 分析。每個處理取2-3幼蟲分別置於不同研缽中液氮研磨，以TRIZOL(Invitrogen公司)試劑提取總RNA，並以UNIQ-10柱式mRNA抽提純化試劑 盒(上海生工生物工程有限公司)獲得4種不同處理mRNA。分別取lpgmRNA 進行cDNA合成，雙鏈cDNA合成採用TakaRa M-MLV RTase cDNA Synthesis Kit(寶生物工程(大連)有限公司)進行。雙鏈cDNA經異丙醇沉澱純化後，以 TakaRa BamHI/Hhal (寶生物工程[大連]有限公司)組合酶切消化，具體參照 BamHI和HhaI內切酶使用說明。酶切完成後於70。C條件下滅酶，並經異丙醇 沉澱獲得消化產物。以T4DNA連接酶(上海生工生物工程有限公司)連接消 化產物與事先設計的2個接頭序列SEQIDNo: 3和SEQIDNo: 4。以連接完成 的cDNA片段為模板，以預擴增引物SEQIDNo: 5和SEQIDNo: 6進行PCR 預擴增，將預擴增產物稀釋20倍後，以選擇性擴增引物組合SEQIDNo: 7和 SEQIDNo: 8進行PCR選擇性擴增。擴增產物以6%變性聚丙烯醯胺凝膠進行 電泳分析，以核酸銀染試劑盒(上海生工生物工程有限公司)進行顯帶，見圖l。目標條帶的選擇標準為隨脅迫強度增加而出現先升後降規律的條帶， 因為具有上述規律的條帶是與生物逆境反應相符合。從凝膠上割取的目標條帶用純水浸提過夜後，取2-4)iL浸提液作為模板，以引物組合SEQIDNo: 7、 SEQIDNo: 8進行PCR，產物在1.5%瓊脂糖凝膠上進行電泳。電泳結束後割 取目標條帶，以UNIQ-10柱式DNA膠回收試劑盒(上海生工生物工程有限公 司)進行片段回收，並插入pUCm-T載體(上海生工生物工程有限公司)，陽 性克隆委託Invitrogen公司進行序列分析。經與美國生物信息資料庫 http:〃www.ncbi.nlm. nih.gov比對，由選擇性擴增引物SEQ ID No: 7和SEQID No: 8所擴增獲得的一個524bp的產物與家蠶、海葵等生物的adh基因具有72G/0 以上的同源性。經Editseq軟體(DNAStar公司)推演，獲得了該基因序列編 碼174個胺基酸，序列比對顯示推演獲得的本發明胺基酸序列與家蠶和伊蚊等 具有79%-92%的同源性。根據對獲得基因的核苷酸序列和推演得到的胺基酸 序列，本發明將獲得的與環境脅迫相關的基因片段定名為茶尺蠖adh基因，其 具體核苷酸序列見SEQIDNo: 1，胺基酸序列見SEQIDNo: 2。 實施例2在4個直徑為21cm的培養皿中央分別用膠帶固定一團脫脂棉球，在棉球上 分別滴上2m域20ml的水模擬溼度脅迫，其中2ml處理為正常溼度組，20ml為 高溼度脅迫組。將200頭2齡茶尺蠖幼蟲分成兩組， 一組在正常溼度條件下飼 喂，另一組在高溼度條件下飼喂。每組各2皿， 一皿用於死亡率觀察，另一皿 用於基因表達研究。培養12和72小時後，在正常溼度和高溼度飼餵組中分別 選取存活的幼蟲2-4頭。以TRIZOL(Invitrogen公司)法提取總RNA，以MMLV 第一鏈cDNA合成試劑盒(上海生工生物工程有限公司)合成cDNA。採用引 物組合SEQIDNo: ll和SEQIDNo: 12進行PCR和電泳。結果顯示，高溼度 環境生長的茶尺蠖幼蟲死亡率比正常溼度處理高60%，同時茶尺蠖幼蟲在高溼 脅迫初期adh基因表達比正常溼度處理高2倍以上，但脅迫時間延長至72小時， 高溼脅迫組adh基因表達僅為正常溼度的30-40%;而正常溼度組在處理過程中 始終處於中等水平，見圖2。說明adh基因表達是一種衡量茶尺蠖等昆蟲飼養 環境好壞的重要指標，通過對該指標的檢測有助於提高實驗昆蟲飼養成活率。因此，我們可以得出如下結論在環境脅迫初期，茶尺蠖的adh基因表達 顯著增強，用以形成相應的蛋白，並消除環境的不利因素，但是當環境脅迫 持續延長時，茶尺蠖adh表達量下降，合成的相應蛋白和消除環境不利因素的 能力下降，並最終導致相應抵禦脅迫能力喪失，導致個體死亡。可見，不利 環境引起adh波動，而正常環境adh表達平穩。可以從adh表達的波動情況推測 昆蟲培養環境是否合適；同時可通過脅迫後期adh表達來推測昆蟲的抗逆性， 即在脅迫後期仍能保持adh高表達，則為抗逆強的個體，反之也然。最後，還需要注意的是，以上列舉的僅是本發明的若干個具體實施例。 顯然，本發明不限於以上實施例，還可以有許多變形。本領域的普通技術人 員能從本發明公開的內容直接導出或聯想到的所有變形，均應認為是本發明 的保護範圍。 SEQIDNo: 1ggatccacag aggtgggtcg catcatcatggttactcttg agctcggtgg caagagccctaaagctgctc tcatcgctca tagagctgctggtaccagga ccttcgtgca atctggcattatcgcccaaa agagatccgt aggcaaccctgacaaagaga tgtttgacaa agtcatggga郷tgcsttg ctggcgg郷tcgtc卿gcttcgcagatg tca已ggatg已catgaaaataagtattctaa agttcgagac cttcgaagag序列表agtgctgcctctgccgtgaacttg犯gaga 60cttgtcatcttcaacgacgccgatgtcgaa120ttcgctaacgccggccaatgctgtgtggct180tcgtagcaaaatctgccgaa240tacgaagatgttgaacsagga^cctcagatc300ttcatcgatgctggaaaascgcaaggagct360aatgttggatttttcgtccagcccaccgta 420gcc卿gaagagatcttcgggccagttcag480gtggt卿ccgcgc524SEQ ID No: 2Gly Ser Thr Glu Val Gly Arg lie lie Met Ser Ala Ala Ser Ala 1 5 10 15Val Asn Leu Lys Arg Val Thr Leu Glu Leu Gly Gly Lys Ser Pro 20 25 30Leu Val lie Phe Asn Asp Ala Asp Val Glu Lys Ala Ala Leu lie 35 40 45Ala His Arg Ala Ala Phe Ala Asn Ala Gly Gin Cys Cys Val Ala 50 55 60Gly Thr Arg Thr Phe Val Gin Ser Gly lie Tyr Asp Lys Phe Val 65 70 75Ala Lys Ser Ala Glu lie Ala Gin Lys Arg Ser Val Gly Asn Pro 80 85 90Tyr Glu Asp Val Glu Gin Gly Pro Gin lie Asp Lys Glu Met Phe 95 100 105Asp Lys Val Met Gly Phe lie Asp Ala Gly Lys Thr Gin Gly Ala 110 115 120Arg Cys lie Ala Gly Gly Gly Arg Gin Gly Asn Val Gly Phe Phe 125 130 135Val Gin Pro Thr Val Phe Ala Asp Val Lys Asp Asp Met Lys lie 140 145 150Ala Arg Glu Glu lie Phe Gly Pro Val Gin Ser lie Leu Lys Phe 155 160 165Glu Thr Phe Glu Glu Val Val Asp Arg 1705'-CTCGTAGACTGCGTACC -3' SEQ ID No: 3 (BamHI接頭)3!- CATCTGACGCATGGCATG-5' SEQ ID No: SEQ ID No:SEQ ID No:5'- CGATGAGTCCTGAGCG -3' 4 (Hhal接頭)3-TACGCTACTCAGGACTC -5'5 (預擴增上遊引物)5，-GTAGACTGCGTACCGATCC-26 (預擴增下遊引物)5，-GATGAGTCCTGAGCGC-3，SEQ ID No: 7 (選擇性擴增上遊引物)SEQ IDNo: 8 (選擇性擴增下遊引物)SEQ IDNo: 9 (選擇性擴增上遊引物)SEQ IDNo: 10 (選擇性擴增下遊引物)，-GACTGCGTACCGATCC AC-3'，-GATGAGTCCTGACGCGCGG-3 ，，-GACTGCGTACCGATCC AT -3'，-GATGAGTCCTGACGCGCGT -3，SEQ IDNo: SEQ IDNo:11 (基因特異性上遊引物)5，-GGATCCACAGAGGTGGGTCG-3，12 (基因特異性下遊引物)5，-GCGCGGTCTACCACCTCTTCG-3'
權利要求
1、一種茶尺蠖乙醛脫氫酶基因adh，其特徵是具有SEQ ID No1所示的核苷酸序列。
2、 如權利要求l所述的基因adh編碼的蛋白質，其特徵是具有SEQIDNO: 2所示的胺基酸序列。
3、 如權利要求l所述的基因adh的用途，其特徵是用於評價昆蟲的抗逆能 力和監測昆蟲的飼養環境。
4、 如權利要求2所述的基因adh的用途，其特徵是所述昆蟲為茶尺蠖。
全文摘要
本發明公開了一種茶尺蠖乙醛脫氫酶基因adh，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。本發明還公開了上述基因adh編碼的蛋白質，其具有SEQ IDNO2所示的胺基酸序列。本發明還公開了上述基因adh的用途用於評價昆蟲的抗逆能力和監測昆蟲的飼養環境。
文檔編號C12N15/53GK101210250SQ20071016481
公開日2008年7月2日 申請日期2007年12月24日 優先權日2007年12月24日
發明者晨 林, 梁月榮, 董俊傑, 鄭新強, 陸建良 申請人:浙江大學