產丁二酸的菌株及其生產丁二酸的方法和應用的製作方法

2023-05-09 17:33:36

專利名稱:產丁二酸的菌株及其生產丁二酸的方法和應用的製作方法
技術領域：
本發明涉及微生物領域，具體而言，涉及一株產丁二酸的菌株及其生產丁二酸的方法和應用。
背景技術：
丁二酸(又名琥珀酸)，是一種常見的天然有機酸，廣泛存在於人體、動物、植物和微生物中。丁二酸作為一種重要的化工原料，在醫藥、食品以及表面活性劑等行業有著廣泛的用途。近年來，隨著化石資源的日益枯竭和環境問題的日益嚴重，採用生物合成法代替傳統的化學合成法製備丁二酸備受矚目，美國能源部將丁二酸列為未來12種最有價值的生物煉製產品之一。
生物合成丁二酸，是利用細菌，真菌等各種微生物，以葡萄糖或其他各種水解液為碳源，經微生物發酵生產丁二酸。利用微生物發酵法轉化可再生資源(葡萄糖、木糖等)，由於原料來源廣泛且價格低廉，汙染小，環境友好，且在發酵過程中可以吸收固定CO2，能有效緩解溫室效應，故成為近年來研究的熱點。
發酵菌株是丁二酸生物合成的關鍵點之一，但大部分菌株只能產生較低濃度的丁二酸。提高丁二酸的發酵產酸能力有很多的方法，然而迄今為止，在純厭氧條件下，高效利用葡萄糖為單一性碳源並高產丁二酸的菌株卻鮮有報導。

發明內容
本發明的目的在於提供一株能夠在純厭氧條件下，高效利用葡萄糖為單一性碳源並高產丁二酸的菌株，以及其產生丁二酸的方法和應用。
為了實現本發明的技術目的，本發明提供了一株產丁二酸的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌co7i) BER208，其保藏編號為CCTCC Ν0:Μ 2012351。
本發明還提供了一種生產丁二酸的方法，包括如下步驟發酵上述提及的大腸埃 MiEscherichia coli) BER208 CCTCC Ν0:Μ 2012351，得到丁二酸。
進一步地，所述方法包括將固體平板培養基培養的大腸埃希氏菌BER208接種於種子培養基中培養得到種子液；然後將種子液接種到發酵培養基中以得到丁二酸。
優選地，所述方法為將經固體平板培養基37攝氏度，厭氧條件培養24小時的大腸埃希氏菌BER208接種於種子培養基，充二氧化碳，在37攝氏度，200轉/分鐘的條件下厭氧培養12小時得到種子液；
將所述種子液按照2%的接種量接種於所述發酵培養基中，充二氧化碳，並在37攝氏度厭氧培養48小時以得到丁二酸。
優選地，所述充二氧化碳均為充二氧化碳2分鐘，以保存培養時的厭氧環境。
優選地，所述固體平板培養基的配方為梓檬酸3 g ·ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · ΛKH2PO4 8 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20I g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg ·L-1, Na2MoO4 ·2Η20 O. 5 mg .L-1,朽1 檬酸鐵 16. I mg .L-1,瓊脂 15_20g/L,葡萄糖 10_15g/L0
優選地,所述種子培養基的配方為蛋白腖10g/L,酵母粉5g/L, NaCl 5g/L,葡萄糖 10-15g/L。
優選地，所述發酵培養基的配方為:檸檬酸3 g · L-1，Na2HPO4 · 12H20 4 g · L-1，KH2PO4 8 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20I g · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg · L-1, Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Ι71，朽1 檬酸鐵 16. I mg · I71，鹼式碳酸鎂 24_42g/L,葡萄糖30-40g/L。
本發明還提供了大腸埃希氏菌{Escherichia coli) BER208在發酵生產丁二酸中的應用。
本發明的產丁二酸的菌株，與現有的產丁二酸的菌株相比，其有益效果在於 本發明大腸埃希氏菌co7i)BER208 CCTCC Ν0:Μ 2012351菌株可以在發
酵培養基中，以葡萄糖為單一性碳源在純厭氧條件下快速生長，並高產丁二酸在厭氧搖瓶中其48小時菌體密度可達到0D_=6. 87，丁二酸產量達到10. 5g/L，而現有的出發菌株大腸埃希氏菌co7i)BER108 CCTCC Ν0:Μ 2012068在相同的條件下，生長速度緩慢，48小時菌體密度僅為0D_=3. 7，丁二酸產量僅為4. 8g/L，相對於出發菌株，本發明生長速度快且丁二酸產量提高了 2倍多，因此本發明菌株具有重大的社會意義和經濟價值。
具體實施方式
本發明的生物材料大腸埃希氏菌co7i)BER208的保藏日期為2012年09月14日，保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國.武漢.武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO: M 2012351。
本發明所述的出發菌株大腸埃希氏菌coli) BER108的保藏單位全稱為中國典型培養物保藏中心，簡稱CCTCC，地址為中國.武漢.武漢大學，其保藏編號為CCTCC NO: M 2012068，其公開來源是申請號為201210138292. 6，
公開日為2012年8月22日，公開號為CN102643770A的中國專利申請。
本發明的大腸埃希氏菌coli) BER208為高產丁二酸的菌株。本發明的大腸埃希氏菌coli、BER208菌落為圓形邊緣整齊，表面光滑，半透明，小凸起。
本發明的大腸埃希氏菌{Escherichia coli ) BER208是將出發菌株大腸埃希氏菌{Escherichia co7i )BER108 (CCTCC NO M 2012068)經連續馴化培養後，利用以葡萄糖為單一性碳源的固體培養基平板，在純厭氧條件下篩選得到可以快速生長的菌株，再經過厭氧搖瓶發酵篩選獲得可以高產丁二酸的菌株為目標菌株，所述篩選方法可以包括如下步驟 I)種子培養基培養將出發菌株大腸埃希氏菌co7i)BER108 (CCTCCNO M 2012068)利用種子培養基培養，37°C，200r/min，在裝液量為IOmL的血清瓶中培養12h得到對數生長期的菌液；2)連續培養馴化誘變將步驟I)中所述的對數生長期的菌液以10%(v/v)的接種量接種到裝有300mL發酵培養基的500mL連續培養裝置中，37°C水浴加熱，通入過濾除菌的CO2維持厭氧環境，並以I. 5mL/h的速率向培養裝置中流加新鮮的發酵培養基。定時取樣檢測培養裝置中菌體的密度，當反應器中菌體密度達到0D_=2 3，並保持48h無較大變化，說明表示菌體在該流加速度下生長穩定，此時馴化過程完成一個循環。將新鮮發酵培養基的流加速度加倍，進行下一個循環的連續培養。直至發酵培養基的流加速度達到12mL/h，菌體生長性能在該條件下維持穩定；
3)固體平板初篩在無菌操作條件下，從步驟2)連續培養裝置中取出2 4mL菌液，用無菌水稀釋I X IO4倍，取100 μ L塗布在固體平板上，37°C厭氧培養24h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；
4)固體平板復篩將步驟3)中篩選到的菌株在固體平板上反覆轉點培養，37°C厭氧培養12h，挑選生長較大，較為飽滿的菌落；
5)厭氧搖瓶發酵篩選將步驟4)中篩選出的菌株接種到種子培養基中擴大培養，37°C，200r/min，培養12h，然後在發酵培養基中發酵，接種量為2% (v/v), 37°C, 200r/min,培養48h ;考察步驟4)中篩選出的菌落中篩選出生長速度快，產酸量高的菌株。
其中，所述種子培養基的配方為蛋白腖10g/L,酵母粉5g/L, NaCl 5g/L,葡萄糖10-20g/L。
其中，所述發酵培養基的配方為梓檬酸3 g ·ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO48 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · ΙΛ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20 Ig · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg · L-1, Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Ι71，朽1 檬酸鐵 16. I mg · I71，鹼式碳酸鎂 24_42g/L,葡萄糖30-40g/L。
其中，固體平板培養基的配方為梓檬酸3 g -T1jNa2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO48 g · ΙΛ (NH4)2HPO4 8 g · ΙΛ NH4Cl O. 2 g · Λ (NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20 Ig · ΙΛ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · ΛMnSO4 · H2O 2· 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · Λ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77mg ·L-1, Na2MoO4 ·2Η20 O. 5 mg .L-1,朽1 檬酸鐵 16. I mg .L-1,瓊脂 15_20g/L,葡萄糖 10_15g/L0
根據以下實施例，可以更好的理解本發明。實施案例中所描述的具體的物料配比，工藝條件及其結果僅用於說明本發明，而不應當也不會限制權利要求
書中所詳細描述的本發明。
實施例I
本實施例說明將大腸埃希氏菌coli) BER108 (CCTCC M 2012068)進行第一步連續培養馴化的方法。
大腸桿菌原始菌株進行第一步連續 培養馴化的方法如下
將凍存管中的大腸埃希氏菌co7i)BER108 (CCTCC M 2012068)作為出發菌株，在裝液量為IOmL種子培養基中的25mL血清瓶中培養，37°C，200r/min培養12h得到對數生長期的菌液；將對數生長期的菌液以10% (v/v)的接種量接種到裝有300mL發酵培養基的500mL連續培養裝置中，37°C水浴加熱，通入過濾除菌的CO2維持厭氧環境，並以
1.5mL/h的速率向培養裝置中流加新鮮的發酵培養基。定時取樣檢測培養裝置中菌體的密度，當反應器中菌體密度達到0D_=2 3，並保持48h無較大變化，說明表示菌體在該流加速度下生長穩定，此時馴化過程完成一個循環。將新鮮發酵培養基的流加速度加倍，進行下一個循環的連續培養。直至發酵培養基的流加速度達到12mL/h，菌體生長性能在該條件下維持穩定，準備實施例2的篩選步驟。 其中，所述的種子培養基的配方為蛋白腖IOg/L,酵母粉 5g/L, NaCl 5g/L,葡萄糖 10_20g/L。
所述發酵培養基的配方為梓檬酸3 g · ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO4 8g.L-1，(NH4)2HPO4 8 g·!/1，NH4Cl 0.2 g · Λ (NH4)2SO4 0. 75 g · Λ MgSO4 · 7H20 I g · ΛCaCl2 · 2H20 10. 0 mg · Λ ZnSO4 · 7H20 0. 5 mg · Λ CuCl2 · 2H20 0. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O
2.5 mg · ΙΛ CoCl2 · 6H20 I. 75 mg · Λ H3BO3 0. 12 mg · Λ Al2(S04 )3 I. 77 mg · ΛNa2MoO4 · 2H20 0. 5 mg .171,朽1 檬酸鐵 16. I mg .171,鹼式碳酸鎂 24_42g/L,葡萄糖 30_40g/ L0
實施例2
本實施例說明篩選得到優良大腸埃希氏菌co7i)BER208的方法。
篩選步驟
I、固體平板初篩
在無菌操作條件下，從連續培養裝置中取出2-4mL菌液，用無菌水稀釋I X IO4倍，取100 μ L塗布在固體平板上，37°C厭氧培養24h，挑選出挑選生長速度快，較為飽滿的菌落。
2、固體平板復篩
將篩選到的菌株在平板上反覆轉點培養，最終得到了菌株BER10806、BER208，BER10811和BER10814顯示了較強的生長速率和生長穩定性。
3、搖瓶發酵篩選
將菌株BER108、BER10806、BER208、BER10811和BER10814接入種子培養基中擴大培養，充二氧化碳2min，37°C，200r/min，培養12h。然後接種到發酵培養基中，IOOmL厭氧血清瓶裝液量 30mL，接種量 2% (v/v),充二氧化碳 2min，37°C，200r/min,培養 48h。
其中，所使用的培養基配方如下
固體平板培養基檸檬酸 3 g .IANa2HPO4.12H20 4 g · L—1，KH2PO4 8 g Γ1, (NH4)2HPO48 g· IANH4Cl O. 2 g.L-1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7H20 I g · L-1，CaCl2 · 2Η20 10. 0mg · ΙΛ ZnSO4 · 7H20 0. 5 mg · Λ CuCl2 · 2H20 0. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · ΛCoCl2 ·6Η20 I. 75 mg ·ΙΛΗ3Β03 0· 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2H20 0.5mg · I71，朽1 檬酸鐵 16. I mg · I71,瓊脂 15_20g/L,葡萄糖 10_15g/L。
種子培養基蛋白腖10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，葡萄糖10_20g/L。
發酵培養基:檸檬酸3 g · I/1，Na2HPO4 · 12H20 4 g · Γ1，KH2PO4 8 g · Γ1，(NH4) 2ΗΡ048 g· IANH4Cl O. 2 g.L-1，(NH4)2SO4 O. 75 g · Λ MgSO4 · 7Η20 I g · Γ1，CaCl2 · 2Η20 10. Omg · ΙΛ ZnSO4 · 7Η20 O. 5 mg · Λ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · ΛCoCl2 ·6Η20 I. 75 mg ·ΙΛ H3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 O. 5mg · L_/朽1檬酸鐵16. I mg · L_S鹼式碳酸鎂24_42g/L,葡萄糖30_40g/L。
檢測各個菌株菌體密度和丁二酸產量如表I所示表I篩選得到的優良菌株和出發菌株的生長及產酸比較
權利要求
1.一株產丁二酸的菌株，其分類命名為大腸埃希氏菌co7i ) BER208，其保藏編號為CCTCC NO:M 2012351。
2.一種生產丁二酸的方法，其特徵在於，所述方法包括如下步驟發酵權利要求
I所述的大腸埃希氏菌{Escherichia coli) BER208,得到丁二酸。
3.根據權利要求
2所述的方法，其特徵在於，所述方法包括將固體平板培養基培養的大腸埃希氏菌BER208接種於種 子培養基中培養得到種子液；然後將種子液接種到發酵培養基中以得到丁二酸。
4.根據權利要求
2或3任一所述的方法，其特徵在於，所述方法為將經固體平板培養基37攝氏度，厭氧條件培養24小時的大腸埃希氏菌BER208接種於種子培養基，充二氧化碳，在37攝氏度，200轉/分鐘的條件下厭氧培養12小時得到種子液； 將所述種子液按照2%的接種量接種於所述發酵培養基中，充二氧化碳，並在37攝氏度厭氧培養48小時以得到丁二酸。
5.根據權利要求
4所述的方法，其特徵在於，所述充二氧化碳均為充二氧化碳2分鐘。
6.根據權利要求
3所述的方法，其特徵在於，所述固體平板培養基的配方為檸檬酸3g · ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO4 8 g · Λ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ(NH4)2SO4 O. 75 g · ΙΛ MgSO4 · 7Η20 I g · Λ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5mg · ΙΛ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · ΛH3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Λ 檸檬酸鐵 16. Img · L—1,瓊脂 15-20g/L,葡萄糖 10_15g/L。
7.根據權利要求
3所述的方法，其特徵在於，所述種子培養基的配方為蛋白腖IOg/L，酵母粉 5g/L, NaCl 5g/L，葡萄糖 10_15g/L。
8.根據權利要求
3所述的方法，其特徵在於，所述發酵培養基的配方為檸檬酸3g< · ΙΛ Na2HPO4 · 12H20 4 g · Λ KH2PO4 8 g · Λ (NH4)2HPO4 8 g · Λ NH4Cl O. 2 g · Λ(NH4)2SO4 O. 75 g · ΙΛ MgSO4 · 7Η20 I g · Λ CaCl2 · 2Η20 10. O mg · Λ ZnSO4 · 7Η20 O. 5mg · ΙΛ CuCl2 · 2Η20 O. 25 mg · Λ MnSO4 · H2O 2. 5 mg · Λ CoCl2 · 6Η20 I. 75 mg · ΛH3BO3 O. 12 mg · Λ Al2 (S04 )3 I. 77 mg · Λ Na2MoO4 · 2Η20 O. 5 mg · Λ 檸檬酸鐵 16. Img · L—1，鹼式碳酸鎂 24-42g/L，葡萄糖 30_40g/L。
9.權利要求
I所述的大腸埃希氏菌co7i)BER208在發酵生產丁二酸中的應用。
專利摘要
本發明公開了一種產丁二酸的菌株及其生產丁二酸的方法和應用。其中，所述菌株的分類命名為大腸埃希氏菌(Escherichiacoli)BER208，其保藏編號為CCTCCNOM2012351。所述菌株在發酵培養基中，以葡萄糖為單一性碳源在厭氧條件下快速生長，並能高產丁二酸，該菌株發酵48小時，OD600達到了6.87，丁二酸產量達到10.5g/L，相對於出發菌株，丁二酸產量提高了2倍多。
文檔編號C12N1/20GKCN102864113SQ201210392035
公開日2013年1月9日 申請日期2012年10月16日
發明者姜岷, 萬青, 張常青, 梁麗亞, 陳旭, 苟冬梅, 劉嶸明, 馬江鋒 申請人:南京工業大學導出引文BiBTeX, EndNote, RefMan