偽狂犬病活疫苗的製備方法及其產品的製作方法

2023-05-23 11:28:56 1

偽狂犬病活疫苗的製備方法及其產品的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種偽狂犬病活疫苗的製備方法，該方法包括：（1）細胞的培養：將細胞接種到細胞培養袋的微載體上，加入細胞培養基，搖動細胞培養袋培養細胞；（2）病毒液的增殖：沉降微載體、洗滌培養的細胞，接種偽狂犬病毒毒種，加入病毒增殖培養基繼續培養細胞，收穫病毒液；（3）將病毒液與保護劑混合，得到活疫苗。本發明方法優化了波浪生物反應器培養ST細胞的各工藝參數，有效提升了ST細胞的培養效率，最終顯著提高了偽狂犬病活疫苗的生產效能以及免疫保護效力。免疫保護效力實驗證實，本發明活疫苗對於豬、牛及綿羊有良好的免疫保護效果，免疫保護效力要顯著優於傳統轉瓶製備的疫苗。
【專利說明】偽狂犬病活疫苗的製備方法及其產品
【技術領域】
[0001]本發明涉及一種偽狂犬病活疫苗的製備方法，尤其涉及一種利用WAVE波浪生物反應器生產偽狂犬病活疫苗的方法，屬於偽狂犬病活疫苗的生產領域。
【背景技術】
[0002]偽狂犬病(pseudorabies, PR)又稱Aujeszky氏病,是由豬皰疫病毒I型所引起的豬、牛、羊等多種家畜、家禽和野生動物的一種以發熱、奇癢(豬除外)及腦脊髓炎為主症的一種急性傳染病。通常引起妊娠母豬流產、木乃伊胎、死胎和產弱仔；初生仔豬出現腹瀉及神經症狀、感染率和死亡率可達100%;母豬出現返情屢配不孕；育肥豬感染後不發病，多呈隱性感染，耐過豬，主要表現生長發育遲緩，飼料報酬率降低等，並可長期帶毒、排毒，成為最危險的傳染源。該病最早發現於美國，後由匈牙利學者Aujeszky首次分離到該病毒，故又稱為奧耶斯基病(Aujeszkys disease)。據報導,全世界已有50多個國家和地區爆發過該病，對養豬業的發展構成了嚴重威脅。本病尚無有效治療藥物，疫苗免疫接種是預防和控制豬偽狂犬病的根本措施。
[0003]目前，偽狂犬病活疫苗的生產主要是轉瓶細胞培養的傳統培養方式，進而增殖偽狂犬病毒。但轉瓶培養細胞增殖較為緩慢而且生產過程中對細胞和病毒的培養條件，如pH、溶氧、糖耗等難以監控和適時補給，無法提供最佳的培養條件，造成該方法自動化程度低，勞動強度大，並因為轉瓶細胞培養環境的不可控性，導致生產的產品質量穩定性不夠，批間差較大。另外提高病毒毒價，保證良好的臨床效果是解決偽狂犬病毒活疫苗產業化的當務之急。而用生物反應器替 代轉瓶生產疫苗株則克服了上述所述不足，成為最具有前途的偽狂犬病活疫苗生產技術之一。
[0004]WAVE波浪生物反應器是採用拋棄型生產技術進行細胞培養的一種新型反應器。其工作方式是，細胞接種於可拋棄的細胞培養袋內，接種細胞的培養袋固定在託盤上以一定的方式搖動，精密控制的搖動保證了培養體系的有效混合和傳氧效率。本發明採用WAVE波浪生物反應器，主要優點有I)免除生物反應器清洗、消毒及其相關認證。2)封閉培養系統，無需固定的管道，簡化細胞培養廠房，縮短反應器安裝和生產產品轉換時間。3)細胞培養袋Cellbag放在特殊設計的搖動平臺上，平臺的搖動在培養液中產生波浪提供培養物混合和氧氣傳遞，產生一個適於細胞生長的完美環境。
[0005]採用WAVE波浪生物反應器生產偽狂犬病活疫苗時，所加入微載體的含量、細胞接種密度、細胞培養袋的搖動參數等生產條件對於偽狂犬病活疫苗的生產效率以及免疫保護效力的高低等有非常顯著的影響，在生產實踐中需要對這些條件進行優化才能有效提高偽狂犬病活疫苗的生產效率以及免疫保護效力。

【發明內容】

[0006]本發明的目的是提供一種利用WAVE波浪生物反應器生產偽狂犬病活疫苗的方法，該方法對微載體的含量、細胞接種密度、細胞培養條件等參數進行了優化，有效提升了偽狂犬病活疫苗的生產效率以及免疫保護效力。
[0007]本發明的上述目的是通過以下技術方案來實現的:
[0008]一種利用WAVE波浪生物反應器生產偽狂犬病活疫苗的方法，包括:(I)細胞的培養:將ST細胞接種到細胞培養袋中的微載體上，加入細胞培養基，搖動細胞培養袋培養細胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養的細胞，接種偽狂犬病毒毒種，加入病毒增殖培養基培養細胞，收穫病毒液；(3)將病毒液與適宜穩定劑混合均勻，經冷凍真空乾燥得到偽狂犬病活疫苗；其中，所述的搖動條件為擺動角度6°、擺動速度為14rpm。
[0009]採用WAVE波浪生物反應器培養ST細胞時，搖動培養參數對於細胞在微載體上的吸附以及細胞生長有非常顯著的影響，為了篩選到最適宜的搖動培養參數以最大限度的促進細胞生長，本發明對搖動培養時的擺動角度以及擺動速度等參數進行了優化考察，觀察不同的培養條件對於細胞的生長所帶來的影響。通過實驗發現，在對於細胞培養袋中的細胞進行搖動培養時，擺動角度以及擺動速度對於細胞的生長有非常顯著的影響；本發明最終發現，當搖動培養時的培養條件為擺動角度6°、擺動速度為14rpm能夠最為顯著的促進細胞的生長，該培養條件下的細胞生長速度顯著高於其它的培養條件。
[0010]此外，細胞接種密度與微載體含量對細胞生長的影響也密切相關，其中重要的標誌是接種時要保證合適的細胞密度與載體的比例關係。在每克微載體接種相同細胞數的前提下，本發明考察微載體(Cytodexl)含量為 lg/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、6g/L、7g/L、8g/L時細胞生長情況，用來確定合適的載體用量。為了生產高滴度的病毒，需要細胞密度較高，同時，為了較快和高效的培養細胞，又要求細胞的細胞擴增倍數較高。從實驗結果可以看出，隨著微載體含量的增加，ST細胞密度會有所增加，但ST細胞擴增倍數卻有所降低。微載體含量為2g/L時，ST細胞生長較快，培養時間為5天時，ST細胞密度達到了 1.86 X IO7g/L，非常顯著的高於其它的微載體的細胞密度；此外，當微載體含量高於2g/L時，ST細胞生長的增加速度不顯著。因此，本發明在細胞培養袋中培養ST細胞時，所加入的微載體的含量優選為2g/L。因此綜合考慮，本實驗微載體含量優選為2g/L。
[0011]在確定了微載體最適宜用量的基礎上，本發明為2g/L的微載體用量，分別以不同的接種密度接種細胞，每天取樣分析，以篩選最適宜的細胞接種密度。從實驗結果可見，當微載體含量相等，不同的接種密度對ST細胞生長影響較大。不同的接種密度對ST細胞生長影響較大。以5 X 104、I X IO5個/mL接種時，接種密度低接種後5天仍在緩慢生長，沒有進入穩定生長期的明顯標誌；以2 X 105、3 X 105、4 X 105、5 X 105、6 X IO5個/mL接種時接種密度高，ST細胞在接種後第2天進入穩定生長期；從實驗結果可見，隨著細胞接種密度的增高，ST細胞生長速度的增加並不與細胞接種密度增加保持同步；當ST細胞接種密度為2 X IO5個/mL時，ST細胞在第4天和第5天後的生長速度要明顯高於其它接種密度的生長速度，因此，本發明優選採用2 X IO5個/mL的接種量接種ST細胞。
[0012]本發明方法優化了波浪生物反應器培養ST細胞的各工藝參數，有效提升了 ST細胞的培養效率，最終顯著提高了偽狂犬病活疫苗的生產效能以及免疫保護效力；免疫保護效力實驗證實，本發明方法所製備的偽狂犬病活疫苗對於家畜有確切的免疫保護效力；本發明方法可用於大規模工業化生產偽狂犬病活疫苗。
【具體實施方式】[0013]下面結合具體實施方案來進一步描述本發明，本發明的優點和特點將會隨著描述而更為清楚。但這些實施例僅是範例性的，並不對本發明的範圍構成任何限制。本領域技術人員應該理解的是，在不偏離本發明的精神和範圍下可以對本發明技術方案的細節和形式進行修改或替換，但這些修改和替換均落入本發明的保護範圍內。
[0014]生物材料及儀器
[0015]1.1、生物反應器:美國Wave Biotech公司WAVE波浪生物反應器。
[0016]1.2、微載體=Cytodex-1 (購自美國通用電氣醫療集團生命科學部)。
[0017]1.3、偽狂犬病毒(Bartha_K61株)購自中國獸醫藥品監察所；通過其它途徑獲得偽狂犬病毒株也可適用於本發明；例如，從中國典型培養物保藏中心分發獲得的保藏編號為CCTCC N0.V201114的偽狂犬病毒株也能適用於本發明。
[0018]實施例1利用WAVE波浪生物反應器生產偽狂犬病活疫苗
[0019]1.細胞的培養
[0020]1.1微載體處理:按培養的終體積稱取微載體(Cytodex-1)適量，用無Ca2+、Mg2+-PBS室溫浸泡過夜，棄去PBS，再用無Ca2+、Mg2+-PBS洗一次，棄去，最後加入無Ca2+、Mg2+-PBS 高壓滅菌(115°C、lOps1、15min)。
[0021]1.2細胞復甦培養:用方瓶培養從液氮罐中復甦的ST細胞，培養條件包括:pH值
7.2、溫度37°C;培養48-72h，形成良好細胞單層時，用於繼續傳代或接種於生物反應器中進行微載體懸浮培養；該過程中使用的培養基為MEM，血清為胎牛血清，使用量為8%。
[0022]1.3微載體培養:用EDTA-胰酶細胞消化液製備細胞懸液，細胞計數後按2 X IO5個/mL的密度接種到細胞培養袋中進行培養。培養的方法參數為:微載體濃度為2g/L、DO值50%、溫度37°C、擺動角度6°、擺動速度14次/min。在培養過程中監控細胞培養袋中葡萄糖的消耗以及乳酸和氨的產生，同時在不同的節點上細胞計數(Cytodexl上的細胞計數先用PBS漂洗2次，經0.1%結晶紫的檸檬酸溶液染色，用血球計數板計數細胞核)，當細胞的密度達到I X 106-2X IO6個/mL時開始灌注，依據細胞的密度、葡萄糖的消耗以每天灌注0.7-2個工作體積的速度，以維持細胞的生成。
[0023]2.病毒液的增殖
[0024]當細胞培養到達第四天時沉降微載體，排出細胞培養袋中液體，加入PBS洗滌細胞，重複洗滌3次，加入病毒維持液並接種偽狂犬病病毒，其中病毒接種劑量為3%、病毒增值的培養基為含1%血清的MEM，pH值7.4，溫度35°C。接毒後每隔一定時間取生物反應器中的微載體，用顯微鏡觀察細胞病變情況，並檢測樣品TCID50，當微載體上的細胞大部分脫落，停止培養，收穫病毒液，於-20°C凍融兩次，得到偽狂犬病毒液。
[0025]2.1病毒含量的測定
[0026]利用TCID50方法進行病毒含量的測定。病毒TCID50測定時，以MEM培養液將培養得到的偽狂犬病毒液作連續10倍稀釋，即10' 10_2……10_8，每個稀釋度取100 μ L加入96孔細胞培養板的孔中，隨後加入經胰蛋白酶-EDTA消化分散的ST細胞懸液，每孔100 μ L(細胞含量以3 X 105/mL左右為宜)，每個稀釋度作8個重複，並設正常細胞培養對照，置5%C02培養箱中，37°C培養，逐日觀察細胞病變和對照，共觀察2~4日，並記錄細胞病變的孔數，按照Reed-Muench法計算病毒的TCID50。同時以相同的方法對用轉瓶培養的偽狂犬病毒液進行TCID50測定。以此， 作為對照組。[0027]實驗結果見表1,由結果表明，利用生物反應器培養的偽狂犬病毒液病毒含量不小於轉瓶培養的偽狂犬病毒液病毒含量。由此可見利用生物反應器培養的病毒要明顯優於轉瓶培養的病毒。
[0028]表1偽狂犬病毒含量
[0029]
【權利要求】
1.一種偽狂犬病活疫苗的製備方法，包括:(1)細胞的培養:將細胞接種到細胞培養袋的微載體上，加入細胞培養基，搖動細胞培養袋培養細胞；(2)病毒液的增殖:沉降微載體，洗滌培養的細胞；接種偽狂犬病毒毒種，加入病毒增殖培養基繼續培養細胞，收穫病毒液；(3)將病毒液與保護劑混合，得到偽狂犬病活疫苗；其特徵在於:步驟(1)中所述的搖動參數為擺動角度6°、擺動速度為14rpm。
2.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的細胞是ST細胞。
3.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:所述的微載體是Cytodex-1。
4.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:微載體在細胞培養袋中的含量是2g/L。
5.按照權利要求1所述的方法，其特徵在於:將細胞按照2X IO5個/mL的接種量接種到細胞培養袋的微載體上。
6.由權利要求1-5任何一項所述方法製備得到的偽狂犬病活疫苗。
7.權利要求7所述的偽狂犬病活疫苗在製備預防或治療由偽狂犬病毒所導致疾病藥物中的用途。
8.一種預防或治療由偽狂犬病毒所導致疾病的藥物組合物，其特徵在於:含有預防或治療上有效量的權利要求6所述的偽狂犬病活疫苗。
【文檔編號】A61P31/22GK103877573SQ201410109323
【公開日】2014年6月25日 申請日期:2014年3月21日 優先權日:2014年3月21日
【發明者】馮建民, 王石, 王國輝, 何玉友, 劉斌, 楊鍵, 李長豔, 廉維, 楊澤彬, 馮會, 柳志光, 白楊, 吳豔麗, 田麗華 申請人:吉林正業生物製品股份有限公司