一種草莓莖尖組培專用培養基及其生產脫毒苗的方法

2023-05-23 23:50:31

專利名稱：一種草莓莖尖組培專用培養基及其生產脫毒苗的方法
技術領域：
本發明屬於組培育苗技術領域，具體說涉及一種草莓莖尖組培專用培養基及其生 產脫毒苗的方法。
背景技術：
草莓(Fragaria ananassa Ducde)是薔薇科草莓屬宿根性多年生常綠草本植物， 屬於多倍體，是一種靠匍匐莖進行無性繁殖的作物，傳統種苗培育的方法是採用匍匐莖繁 殖的無性繁殖方式，效率較低，不利於優良品種的推廣，而且極易感染病毒。我國已鑑定明 確的草莓病毒有四種，即草莓斑駁病毒(SMOV)、草莓輕型黃邊病毒(SMYEV)、草莓皺縮病毒 (SCRV)和草莓鑲脈病毒(SVBV)。種苗普遍感染病毒是草莓生產中的瓶頸問題，感染病毒的 草莓比未感染病毒的草莓長勢弱、抗性差、產量明顯下降，果品品質與商品性狀變劣，嚴重 影響了這一名優種植業的穩步發展。目前，解決草莓的病毒病主要是通過草莓脫毒組培技 術，即通過花葯組織培養、微莖尖組織培養等技術脫去病毒病原獲得無毒草莓再生植株，使 草莓種苗恢復品種原種優良種性，以達到優質、高產之目的。草莓的莖尖培養是獲得無病毒 植株的重要途徑。在莖尖培養過程中，應根據外植體來源和生長狀況不同，對培養基中激 素濃度的大小及相互之間的配比進行調整，從而得到某種材料及相應外植體的最適組培方 法。紅顏草莓(又稱紅頰草莓，日本99號，紅臉頰)，是目前最優秀的日本系列草莓。 紅顏草莓生長勢強，植株較高(25釐米)，結果株徑大，分生新莖能力中等，葉片大而厚，葉 柄淺綠色，基部葉鞘略呈紅色，匍匐莖粗，抽生能力中等，花序梗粗，分枝處著生一大一小兩 完全葉。每個花序4至5朵花，花瓣易落，不汙染果實。該品種果個較大，最大可達100多 克，一般30至60克。果實圓錐形，種子黃而微綠，稍凹入果面，果肉橙紅色，質密多汁，香味 濃香，糖度高，風味極佳，果皮紅色，富有光澤，韌性強，果實硬度大，耐貯運；但紅顏草莓育 苗不易，初代培養脫毒效果差，汙染及玻璃化問題，初代莖尖萌發率和繁育係數低，移栽成 活率不高，繼代快繁培養過程中，經常會出現一種生長異常的試管苗即玻璃苗。表現出植株 矮小、葉色淺且皺縮，呈水晶樣透明或半透明水漬狀，莖葉變脆硬，易碎，嚴重影響繁殖率， 給生產造成很大損失。

發明內容
本發明的目的在於提供一種莖尖組培專用培養基。包括初代培養基、繼代培養基 和生根培養基。本發明的另一目的在於提供一種草莓莖尖組織培養生產脫毒苗的方法。一種草莓莖尖組織初代培養基，該初代培養基是含有濃度為0. 2 0. 5mg/L的 6-苄氨基嘌呤(BA)和濃度為0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸(NAA)的MS培養基，也就是說是以MS 培養基為基礎培養基，然後向MS培養基中添加濃度為0. 2 0. 5mg/L的6-苄氨基嘌呤(BA) 和濃度為0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸(NAA)；
上述初代培養基中還包含0. 02mg/L的赤黴素(GA3)或/和0. 3mg/L的激動素 (KT)；上述初代培養基中0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸(NAA)可以用0. 2mg/L的吲哚乙酸 (IAA)來代替。一種草莓莖尖組織繼代培養基，該繼代培養基是含有濃度為0. 2 0. 5mg/L的
6-苄氨基嘌呤(BA)的MS培養基；上述繼代培養基中還包括0. 2mg/L的吲哚乙酸(IAA)。一種草莓莖尖組織生根培養基，該生根培養基為1/2MS ；上述生根培養基還包含0. 1 0. 3mg/L的吲哚丁酸(IBA)、0. 5 1. Omg/L的吲哚 乙酸(IAA)或0. 01 0. lmg/L的萘乙酸(NAA)。一種草莓莖尖組織培養生產脫毒苗的方法，包括以下操作步驟(1)熱處理將無病健壯的日本紅顏草莓苗放入人工氣候箱中，一天中16小時在 40 41°C、有光照的條件下處理，其餘18小時在35°C、黑暗條件下處理，持續變溫處理4_5 周；(2)材料的採集及消毒取步驟⑴熱處理後的草莓苗匍匐莖頂芽，進行滅菌消毒 處理；(3)莖尖初代培養在解剖鏡下從滅菌消毒後的頂芽上切取0. 2-0. 5mm大小的莖 尖生長點，接種到上述的初代培養基中，暗培養5-7天後，光照培養35-45天至分化出叢生 芽，其中，光照強度為1500-20001x，光照時間為10h/d，溫度25士2°C ；(4)繼代培養將初代培養分化出來的叢生芽轉接到上述繼代培養基中培養 25-35天，光照強度為2000-30001x，光照時間為14h/d，溫度25士2°C，繼代培養代數控制在 5-8 代；(5)生根培養將經繼代培養的草莓苗轉到上述生根培養基中促使其生根，生根 培養20-35天；(6)草莓苗的馴化及移栽將生根培養後的瓶栽草莓苗置於待生長條件下煉苗
7-10天，移栽時開蓋鍛鍊l-2d，然後將其移栽至含有基質的營養缽中。所述移栽具體為將生根培養後的瓶栽草莓苗置於待生長條件下煉苗7-10天，移 栽時開蓋鍛鍊l-2d，然後把草莓苗取出，用水衝掉培養基，用1000倍百菌清浸泡5min後扦 插到8X8營養缽中，所用基質為袋裝富養基質，扦插完畢後覆膜保溼7-10天，保持相對溼 度80%以上，溫度30°C以上加蓋遮陽網，7-10天後逐步撤膜。步驟⑵中所述頂芽為2_3cm長，滅菌和消毒方法為清水衝洗2_3小時後，依次 用75%酒精消毒30s，5%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，然後再用無菌水衝洗5_8次。所述0. 2-0. 5mm大小的莖尖生長點帶2_3個葉原基。步驟(4)中繼代培養達到第5代後，包括第5代，使用的繼代培養基中硝酸銨濃度 降為原濃度的1/2-1/4，繼代培養基中其他成分不變。步驟(6)所述基質為本領域常規使用的基質配方，比如草碳、蛭石和珍珠巖的混 合物。所使用的培養基的pH為5. 7-5. 8。本發明的有益效果本發明的草莓脫毒快繁體系方便實用、脫毒效果好、繁殖係數
4高、遺傳穩定性好而且再生率高，具體如下①本發明的組培方法步驟(2)採取的熱處理結 合莖尖培養脫毒，使草莓苗的脫毒效果達到100% ；②在初代培養過程中往往會褐化嚴重， 大大降低誘導萌發率，本發明通過暗培養5-7天，同時降低培養溫度來防止褐化，褐化比例 明顯減少；③繼代培養中玻璃化是普遍嚴重的問題，在這方面本發明主要是通過降低銨態 氮與控制代數同時嚴格控制溫度來解決，一般繼代培養5代以後，培養基中的大量元素硝 酸銨的濃度降為原濃度的1/2-1/4，一般繼代控制在8代以內，本發明的繁育係數為5-10 ； ④採用本發明初代培養基對紅顏草莓莖尖進行誘導分化培養，其莖尖萌發率為50-65%，而 通常情況下莖尖萌發率僅為40%左右；⑤採用本發明生根培養基對紅顏草莓莖尖進行生 根培養，其誘導生根率90%以上，平均根數5-10條，根長3-8cm不等；⑥本發明的草莓苗的 移栽成活率為95%以上。⑦將本發明方法獲得的草莓苗進行大規模生產種植，結果表明，草 莓畝產量達到3500Kg/畝。本發明方法可作為商業用途的草莓苗脫毒方法在生產上的大規 模使用。
具體實施例方式實施例1含有不同激素的初代培養基培養紅顏草莓莖尖的實驗將無病健壯的日本紅顏草莓苗放入人工氣候箱中，一天中16小時在40°C、有光照 的條件下處理，其餘18小時在35°C、黑暗條件下處理，持續變溫處理4周；然後獲取頂芽 2-3cm長，清水衝洗2-3小時後，依次用75%酒精消毒30s，5%次氯酸鈉溶液消毒lOmin，然 後再用無菌水衝洗5-8次；在解剖鏡下切取0. 2-0. 5mm大小的莖尖生長點，接種到上述的 初代培養基中，暗培養5天後進行光照培養，光照強度為20001x，光照時間為10h/d，溫度 25士2°C ；各初代培養基設兩個重複，每個處理接種莖尖數為50個，莖尖萌發率統計以莖尖 生長點接種後40天分化出的叢生芽為準，莖尖萌發率％ =(萌發出芽的莖尖數/接種總莖 尖數)X 100%，結果見表1。配製初代培養基以MS為基本培養基，向其中添加不同濃度的激素(見表1)，共 四種培養基，PH調節至5. 7-5. 8，高壓滅菌20min ；表1含有不同激素的初代培養基及其莖尖萌發率
權利要求
一種草莓莖尖組織初代培養基，其特徵在於，該初代培養基是含有濃度為0.2～0.5mg/L的6 苄氨基嘌呤和濃度為0.1 0.2mg/L的萘乙酸的MS培養基。
2.根據權利要求1所述的草莓莖尖組織初代培養基，其特徵在於，所述初代培養基中 還包含0. 02mg/L的赤黴素或/和0. 3mg/L的激動素。
3.根據權利要求1所述的草莓莖尖組織初代培養基，其特徵在於，所述初代培養基中 0. 1-0. 2mg/L的萘乙酸用0. 2mg/L的吲哚乙酸來代替。
4.一種草莓莖尖組織繼代培養基，其特徵在於，該繼代培養基是含有濃度為0. 2 0. 5mg/L的6-苄氨基嘌呤的MS培養基。
5.根據權利要求4所述的草莓莖尖組織繼代培養基，其特徵在於，所述繼代培養基中 還包括0. 2mg/L的吲哚乙酸。
6.一種草莓莖尖組織生根培養基，其特徵在於，該生根培養基為1/2MS培養基。
7.根據權利要求6所述的草莓莖尖組織生根培養基，其特徵在於，所述生根培養基還 包含0. 1 0. 3mg/L的吲哚丁酸、0. 5 1. Omg/L的吲哚乙酸或0. 01 0. lmg/L的萘乙酸。
8.—種草莓莖尖組織培養生產脫毒苗的方法，其特徵在於，包括以下操作步驟(1)熱處理將無病健壯的日本紅顏草莓苗放入人工氣候箱中，一天中16小時在40 41°C、有光照的條件下處理，其餘18小時在35°C、黑暗條件下處理，持續變溫處理4-5周；(2)材料的採集及消毒取步驟(1)熱處理後的草莓苗匍匐莖頂芽，進行滅菌消毒處理；(3)莖尖初代培養在解剖鏡下從滅菌消毒後的頂芽上切取0.2-0. 5mm大小的莖尖生 長點，接種到上述的初代培養基上中，暗培養5-7天後，光照培養35-45天至分化出叢生芽， 其中，光照強度為1500-20001x，光照時間為10h/d，溫度25士2°C ；(4)繼代培養將初代培養分化出來的叢生芽轉接到上述繼代培養基中培養25-35天， 光照強度為2000-30001x，光照時間為14h/d，溫度25士2°C，繼代培養代數控制在5_8代；(5)生根培養將經繼代培養的草莓苗轉到上述生根培養基中促使其生根，生根培養 20-35 天；(6)草莓苗的馴化及移栽將生根培養後的瓶栽草莓苗置於待生長條件下煉苗7-10 天，移栽時開蓋鍛鍊l-2d，然後將其移栽至含有基質的營養缽中。
9.根據權利要求8所述的草莓莖尖組織培養生產脫毒苗的方法，其特徵在於，所述移 栽具體為將生根培養後的瓶栽草莓苗置於待生長條件下煉苗7-10天，移栽時開蓋鍛鍊 l-2d，然後把草莓苗取出，用水衝掉培養基，用1000倍百菌清浸泡5min後扦插到8 X 8營養 缽中，所用基質為袋裝富養基質，扦插完畢後覆膜保溼7-10天，保持相對溼度80%以上，溫 度30°C以上加蓋遮陽網，7-10天後逐步撤膜。
10.根據權利要求8所述的草莓莖尖組織培養生產脫毒苗的方法，其特徵在於，步驟 (4)中繼代培養達到第5代後使用的繼代培養基中硝酸銨濃度降為原濃度的1/2-1/4。
全文摘要
本發明公開了一種屬於組培育苗技術領域的草莓莖尖組培專用培養基。包括初代培養基、繼代培養基和生根培養基。所述初代培養基是向MS培養基中添加濃度為0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤和濃度為0.1-0.2mg/L的萘乙酸；所述繼代培養基是向MS培養基中添加濃度為0.2～0.5mg/L的6-苄氨基嘌呤；所述生根培養基為1/2MS培養基。本發明還公開了利用上述培養基培養草莓莖尖組織生產脫毒苗的方法，包括草莓苗的熱處理、取材滅菌、初代培養基、繼代培養、和生根培養基和移栽等步驟。本發明的草莓脫毒快繁體系方便實用、脫毒效果好、繁殖係數高、遺傳穩定性好而且再生率高，可作為商業用途在生產上的大規模使用。
文檔編號A01H4/00GK101946702SQ20101025287
公開日2011年1月19日 申請日期2010年8月13日 優先權日2010年8月13日
發明者王立府, 路河, 郭仰東, 陳懷勐, 高麗 申請人:北京金六環農業園