通過系統的dsrna治療使宿主防禦介質進入生物液體中的製作方法

2023-05-14 07:32:16 2

專利名稱：通過系統的dsrna治療使宿主防禦介質進入生物液體中的製作方法
包括眼淚，陰道分泌物，和男性精液(富含精子)在內的生物液體可含有各種能引起和傳播各種可怕疾病的微生物(真菌，細菌，病毒)。經常採用局部的或直接的抗微生物處理(泡沫體，噴霧劑等)，儘管其極限值是由於微生物的隔絕性質，這些微生物相對地不易受到處理的影響。也可憑藉局部刺激限制局部施用，從而增強其引起變態反應的潛力。我在此描述雙鏈核糖核酸(dsRNA)的腸道外給藥途徑，dsRNA可導致宿主防禦介質意外釋放到各種生物液體(包括在性交過程中正常交換的液體)中。因此，我已描述了一種降低各種微生物傳染力和傳播的新技術，這些微生物包括與由性病瘤，皰疹和人類免疫缺陷病毒等引起的各種疾病有關的微生物。
可在防治感染和癌症中起決定性作用的新產物是所謂免疫調節劑，諸如幹擾素(IFN)，白細胞介素(IL)和腫瘤壞死因子(TNF)。它們均為蛋白質藥物，可增強和激發機體天然的抗病力。然而，這種含有蛋白質的產品一般可以液體或片劑形式給藥，因為在其進入血流之前，可在胃中破壞蛋白質。此外，腸道外(靜脈內，肌內或皮下)給藥也可產生討厭的副作用，特別是在藥物濃度較高時或在極長的治療時間內。因此，研究者們試圖開發這樣的藥物，即用於皮膚，眼睛，特別是抵抗各種性病的局部有效製劑。例如，Rapp和Wrzos(AntimicrobialAgentsandChemotherapy，第28卷，第449頁，1985)描述了一種避孕藥膏，其中抗病毒劑(IFN)與非離子型表面活性劑去汙劑結合，其主要目的在於使性交的一方(或雙方)不受皰疹病毒感染。這種局部用製劑的相對效力等還未闡述;但以前使用局部用抗病毒製劑的成功率是有限的。這種方法的限制因素包括隔絕性質(不易受製劑的影響)或某些病毒微粒以及機體受感染區降低的局部免疫能力(不可能作出持久的治療應答)。
用幹擾素透導物dsRNA特別是多聚I.C的局部組合物，持續釋放治療感染對IFN敏感的病毒的組織，諸如皮膚，眼睛和黏膜的病毒(單純性皰疹)感染，如在美國專利4，283，393號(Field等人)中所述。該專利文獻也描述了局部用抗病毒劑，如作為單純性皰疹失活劑的非離子型表面活性劑，如在美國專利4，020，183(Asculai等人)中所述，其可單獨使用或與幹擾素結合使用，見美國專利4，507，281號(Asculai等人)。
通過一組令人驚奇而新穎的觀察，我已克服了先有技術的方法和材料中這些固有的限制因素，在觀察中我證明了dsRNA的腸道外給藥可引起生物活性dsRNA片段的釋放，這些片段易於穿過血一腦屏障並進入區域化液體，包括唾液，眼淚，漿液，漿液性滲出物等等。這些抗病介質易於進入各種生物液體-甚至在這些液體內缺乏可測的完整dsRNA。
這裡所用的「區域化體液」是指來自系統血液循環以外的局部化體液。這些區域化體液包括在漿膜表面，黏膜表面，滑襯，尿道表面，頸口襯上的液體，腦脊髓液並位於圍液腔內。
我特別說明能夠直接攻擊病毒並同時裝備局部免疫系統的介質，如在泌尿生殖系統中的介質。通過實施本發明，我想明確地說明如何自發地減少男性精液或可能消滅潛在高水平的病毒(包括HIV，皰疹病毒和細胞肥大病毒)，這些病毒在其他方面能使自身和其性夥伴患各種可怕的疾病。本發明也與生產在滲出液或漏出物(關節炎的關節)和腦脊髓液內的抗病介質緊密相關。因此，本發明與各種各樣的疾病(如關節炎和中樞神經系統的疾病)直接相關。
在1987年3月11日公開的，題為「雙鏈RNA對病毒相關活動的調節」的歐洲專利申請0213921中，本發明人描述了在人的細胞培養物中HIV受到dsRNA的抑制，特別是用Ampligen作為原型dsRNA時。


圖1是一個三部分的高壓液相色譜(HPLC)圖，在給與實例1患者AdsRNA之前和之後測定天然(2′-5′-寡腺苷酸/RNA酶L)抗病毒途徑中患者生物液體中的各種組分。
圖2是顯示實例1患者B標準曲線⑥和HPLC分析結果④和⑤的三部分圖。
圖3是顯示dsRNA對用dsRNA預處理的細胞被細胞肥大病毒感染的抑制作用與實例4所述未處理細胞對比的圖。
本發明描述在機體暴露於病毒前激活天然抗病毒途徑和裝備個體免疫系統以防治疾病的程序，激活的目的是誘導患者機體將抗病介質釋放到各種生物液體中，包括局部化體腔內的生物液體，如下所述。dsRNA，最好是失配的dsRNA片段的腸道外給藥(詳見下述)導致生物活性dsRNA片段(有時被稱為抗病介質)釋放到這些生物液體中，甚至在這些液體中缺乏可測的完整dsRNA。這些生物活性dsRNA片段易於穿過血一腦屏障和其他被組織與一般血液循環分隔開的體腔而進入所期望的液體中。
測定生物液體中失活宿主/患者防禦介質的診斷試驗程序也被描述了，而且如果不夠的話，可施用dsRNA，施用量和時間應足以降低一種或多種致病物的量和/或減輕病變並修復必要的dsRNA成為生物活性片段，從而改進檢驗時液體中防禦介體的生化參數。
用本發明的方法診斷和/或治療的疾病可以是病毒性疾病，例如，包括細胞肥大病毒在內的皰疹病毒類，包括HIV在內的逆轉錄病毒類，也可以是發炎疾病(例如關節炎)，細菌敏感性疾病或真菌或原生動物引起的疾病。
在血流以外的生物液體中有許多潛在隔開的致病物。系統施用的藥物大分子(蛋白質，核酸等)通常不易進入這些區域化生物液體(不包括血液)。如本文所用和醫藥領域中所知，腸道外給藥手段可通過靜脈內灌注等使藥直接進入血液，或通過最初的肌內或皮下注射將藥物大分子釋放到血流易於進入的區域。這些高分子量大分子也可適當地裝入膠囊，包上腸溶衣或加以保護後口服，它們不會被胃腸道上部的pH和酶所破壞。所有這些釋放方式最終都會在血流中或多或少地達到可測的水平或產生大分子，但不會在其它生物液體(漿液)中-當然至少不會以具有高度生物活性的形式或構型測得。
不能到達這些遠側區域化液體的主要原因是物理屏障(膜，細胞等)，它們適用於保護各種體腔(泌尿生殖道，關節，口腔，中樞神經系統等)使致病物不會從一個體腔進入另一個體腔(即，致病物傳播)。因此，儘管這些物理屏障在防止疾病傳染和減少微生物(包括病毒傳播方面對人類有顯著的價值，但它們對抗病物質(如免疫調節劑)的有利分布產生很大的阻礙，這種阻礙傾向(a)大分子(雖然不總是如此)，和(b)抗病物質不易穿透這種包括細胞/膜梯度的「屏障」。因此，研究者們都在尋求使這類免疫調節劑/抗病毒劑/抗癌化合物通過生理上適合的屏障(如棉塞，保險套等)直接釋放到局部化體腔內的方法。到目前為止，這類方法只取得了有限的成功。
在漿液腔(如最初進入人體的入口)使廣度驚人的致病微生物隔開。關於衣原體(與骨盆發炎和不育有關)和各種病毒，性病(與性交有關)的傳染方式極為驚人。例如，生殖器皰疹和口部皰疹，細胞肥大病毒，生殖器瘤和逆轉錄病毒(特別是HIV)的傳播速度都是驚人的並且目前沒有跡象表明象基於幹擾素的局部用製劑或幹擾素一誘導物局部用製劑等方法可作為確定的治療或預防方法。
本發明的目的在於設計一個治療方式，使得在各種大量遍及患者體內的漿液中有效地產生抗病介質;這種治療方法可單獨使用或與局部治療方法結合起來。本發明另外的價值在於它可與傳統的方法(如浸有幹擾素的保險套等)協力實行，如果需要對幹擾素敏感疾病達到更高程度的局部保護。
我已觀察到以前未測出的生化異常，其中與機體抵抗癌症和病毒性疾病的防禦機制有關的關鍵酶(RNA酶L)以加速且明顯失控的方式起作用。這些和其它觀察見我於1987年7月17日提交的編號為07/074，649的共同未決美國專利申請，題目為「與失控腫瘤和病毒生長周期相關的異常代謝途徑雙鏈RNA校正」，其內容作為參考合併於此。在各個實驗中，我比較了這兩種具有異常RNA酶L的不同細胞和具有正常量RNA酶L細胞抵抗病毒攻擊的相對能力。我觀察到子代逆轉錄病毒的效價(產率)在那些具有異常RNA酶L活性的細胞中明顯增高，對於NCP其產生得如此迅速。
雙鏈RNA，特別是失配dsRNA，使RNA酶L動力學和降解產物恢復正常(見上述美國專利申請07/074，649所報導)。此外，通過雙鏈RNA使之恢復正常的速度可通過預先與淋巴激活素接觸而加快。
雙鏈RNA(dsRNA)是雙鏈合成多聚核苷酸複合物。「失配dsRNA」是指其中在配對鏈之間的氫鍵(鹼基堆積)是相對完整的，即，每29個連續的鹼基殘基平均不到一個鹼基對的氫鍵被打斷的dsRNA。失配是RNA雙螺旋的正常幾何形狀被代表dsRNA易受攻擊點(易被核糖核酸酶酶解)的鏈向內凹陷(或向外凸起)而打斷。這樣也可理解「失配dsRNA」。
ds RNA可以是含有一定比例的尿嘧啶鹼基或鳥嘌呤鹼基，例如1∶5～1∶30這類鹼基的多聚肌苷酸和多聚胞苷酸複合物(多聚I.(C4-29X＞U或G)。
ds RNA的通式可為r In·(C11-14，U)n或r In·(C12.U)n。n的值從4到29。下面討論其它適宜的ds RNA實例。
本發明優選的失配dsRNA是基於選自poly(Cn，G)的共聚核苷酸，其中n是4-29的整數，並為多聚核糖肌苷酸和多聚核糖胞苷酸複合物的失配類似物，通過修飾r In·rCn以沿著多聚核糖胞苷酸(r Cn)鏈摻入未配對鹼基(尿嘧啶或鳥嘌呤)形成失配ds RNA。此外，也可通過修飾多聚核糖肌苷酸(r In)的核糖基骨架，例如含有2′-O-甲基核糖基殘基，從多聚肌苷酸·多聚胞苷酸得到ds RNA。Carter和Ts′O在美國專利4，130，641和4，024，222中描述了這些r In·rCn的失配類似物，優選失配類似物的通式為r In·r(C11-14，U)n和r In·r(C29，G)n，其揭示的內容作為參考合併於此。所述的ds RNA一般是適用本發明的。
在優選的失配ds RNA，r In·(C12，U)n中，包括一段未打斷的6-12個鹼基對的區域，即，RAN螺旋的半圈到一整圈，作為使淋巴激活素釋放的生物觸發器和天然抗病毒途徑中酶的專性細胞內輔助因子。包括尿嘧啶基的失配區定期插入多聚嘧啶鏈以加速ds RNA水解，從而防止毒性。
用於本發明的失配dsRNA的其它實例包括多聚(I)·多聚(C4，U)多聚(I)·多聚(C7，U)多聚(I)·多聚(C13，U)多聚(I)·多聚(C22，U)多聚(I)·多聚(C20，G)多聚(I)·多聚(C29，G)和多聚(I)·多聚(Cp)23G＞p如在此所討論的，應了解到淋巴激活素包括幹擾素，最好是幹擾素α，白細胞介素，特別是白細胞介素2(IL-2)和重組白細胞介素-2(rIL-2)，和腫瘤壞死因子(TNF)。也包括在與淋巴激活素接觸的動物中形成的淋巴激活素活化殺傷(LAK)細胞。
當用幹擾素(α)作為淋巴激活素時，給藥量為每毫升患者體液含0.01-100，000IRU。當IL-2，最好是r IL-2為淋巴激活素時，給藥量為每公斤患者體重給大約102IL-2單位，直到接近患者不能接受的毒性水平，可高達106IL-2單位。然而，最有效的，毒性反應易處理的量為每公斤體重大約103～104IL-2。
dsRNA的常用給藥量為每毫升患者體液0.1～1，000μgdsRNA。體液是指血清，鹽，維生素等組成的溶液，其在生物體內循環並浸溼組織。患者的體液量可用醫學上可得到的表明受體重量與其體液量相互關係的表來確定，該表顯示了患者體液總量和供與必要量的dsRNA平衡的體液量。例如，一位60或70公鎦氐幕頰擼涮逡毫吭嘉 ～6升。當同時施用兩種藥劑(dsRNA和淋巴激活素)時，可以混合物形式分別，但同時給藥，或相繼給藥。
dsRNA和一種淋巴激活素「結合」給藥包括兩種藥劑以治療混合物的形式一起給藥，也包括兩種藥劑分別但同時給藥，例如，通過不同的靜脈內路線進入同一個體內。「結合」給藥還包括單獨給一種藥物，其中先給藥物之一，不久後再給第二種藥物。
實施例1對幾組體重為40～70公斤的個體，每周靜脈內注射20～1000克失配ds RNA[AMPL IGEN(HEM Research，Inc.，Rockville，MD)，通式為r In·r(C12，U)n的失配ds RNA]並測定其漿液(特別是陰道分泌液和男性精液)中可能存在的ds RNA誘導宿主防禦介質。在伴隨的臨床試驗中，在用幹擾素或白細胞介素灌注的個體中研究了相似的參數以確定這些方法的特異性。在光學顯微鏡下，從受治療患者中分離出的液體包含各種細胞，包括單核細胞，扁平上皮(女性外生殖器樣品)和精子(男性精液)以及相當無定形細胞(「碎片」)。
用dsRNA治療了三例患者，不同時間內觀察到的結果總結於下表中表1系統dsRNA治療對區域化合物液體中的可收集病毒水平的作用患者時間外源dsRNA共培養所載病毒(接受量(克))1.患者A預處理00.6，0.8，0.5(男，患有4周1.60.3，0.25，0.25HTLV-Ⅲ30周120.2，0.15，0.15感染)2.患者B預處理01.5，1.2，1.2(男，患有8周2.80.6，0.50.7THLV-Ⅲ40周10.00.15，0.10，0.18感染)病毒效價(PFU)3.患者C預處理01x10，2x10，2x10(女，患有慢性8周2.62x10，5x10，1x10單純性皰疹36周10.8＜1x10，＜1x10，＜1x10(HS)2型感染)
取2.0～4.0cc患者A和B的精液，用最近報導的外周血單核細胞測定方法Ⅰ(Carter等人，Lancet，第1卷，1987年6月6日，第1287頁)通過共培養測定之，精液中可恢復的HIV-Ⅲ有很高效價。簡言之，從正常供體中取血液單核細胞，用PHA刺激2-4天並繼續培養28天，然後用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)測定細胞外病毒。共培養效價的定義為在減去陰性對照值後用ELISA法測得的平均光密度(在490nm處的OD值)(小於0.1)。患者C患有慢性單純性皰疹，表現在陰道分泌物中，與圍肌囊形成有關。用Rapp所述方法利用在35mm平板上增殖的融合HEL細胞培養單純性皰疹(Rapp等人)，AntimicrobAgentChemoth.，第28卷，第449頁，1985)。
附圖1和2報導了在ds RNA r In·r(C12，U)n單獨和與淋巴激活素結合系統給藥之前和之後，用HLPC法測定患者體液樣品的結果。在圖1中，用三氯乙酸(TCA)和丙酮沉澱法製備了所有樣品，圖2中的④和⑤樣品也是如此製得。在圖2中，用⑥建立一條標準校準曲線，如下所述。圖的排列如下圖1，③是治療前的患者A;②是治療4周後的患者A;①是治療12周後的患者A;圖2，⑤是治療前的患者B，④是治療期間的患者B;⑥是標準曲線。圖1和2可與上述表1對比。
在dsRNA系統給藥後用高壓液相色譜法(HPLC)測定患者樣品，結果表明宿主防禦介質增加。對於天然(2′-5′寡聚腺苷酸/RNA酶L)抗病毒途徑中的各種成分，測定了患者的陰道分泌液(3號)和精液(1號和2號)，見我最近描述的外周血單核細胞(Carter等人，Lancet，如上所述;也見Kariko等人，Biochem.Biophys.Res.Comm.第128卷，695頁，1985年和Suhadolnik等人，Biochemistry，22卷，4153頁，1983年)。結果如圖1A，1B和1C所示。我特別發現了在dsRNA給藥前所有系統組分都幾乎沒有可測的活性。然而，在dsRNA系統給藥期間，我觀察到在這些漿液中介質特別豐富，如圖1和2所示，介質的富集在動力學上與在這些相同位點上病毒表達的降低和完全沒有可測的大分子dsRNA相關聯。這些值是用我以前報導的快速吸印和液體閃爍分光光度測定法測得的(Brodsky等人，J.Biol.ResponseModifiers，第4卷，669頁，1985年)。
為估價該方法的特異性，我們還研究了高用量(＜10毫IRU(d))不同幹擾素和白細胞介素處理的相似個體(或動物)，在這些區域化體液中沒有顯示抗病介質作用的加強。然而當系統地將淋巴激活素和失配雙鏈RNA結合注射，在這些區域化體液中明顯加強了該調節因子的作用。高壓液相色譜結合放射結合，放射免疫和rRNA酶解試驗證實作為用於體內任何處的dsRNA結果的特異的新2′-5′寡腺苷酸，當其用足夠量時可預定疾病，表1清楚地說明了這一結果。
用TCA丙酮沉澱製備樣品後，將其進行高壓液相色譜鑑定(見lee和Suhadolnik，Biochemistry Vol，24 p 551，1985)。用Waters C18微米Bondapark分析柱，通過含甲醇和水的磷酸銨緩衝液(pH7.0)展開梯度(柱長50mm)。命名為＃6(圖2)的色譜表示用已證實為P3A3和P3A4作的標準校正色譜，P3A3和P3A4為酶促合成的(見Layley等人Europ.J.Biochem.，Vol.143，P165，1984，參考資料也已提及)。關鍵的分離物為高壓液相色譜的峰部分，它們出現在該特定色譜6.8～7分鐘和約12分鐘洗脫出來的部分，這些峰是大部分有生物活性的介質，將其命名為P3A3和P3A4，它們分別是2′-5′相連寡腺苷酸介質的三聚體或四聚體。值得注意的是表1的患者A[用其射出的精液分析預處理(圖1，③)和後處理(②4周時和①12周後)]用標準核糖核酸酶L酶解測定顯示兩種有生物活性的2′-5′寡腺苷酸水平都逐級增加，用HPLC測定證實其結構為2′-5′寡腺苷酸的分子的增值水平。從患者B得到的結果與患者A相似(未給結果)。圖2表示在系統dsRNA治療前(圖2，⑤和治療期間(圖2，④用患者C陰道分泌物所得結果。值得注意的是對患者C，比較其表1和圖2，看出其感染皰疹病毒水平隨著根據其生物活性和證實的化學結構測得的介質的增加而急劇降低。
由於不想被任何特定理論和操作方式所束縛，我們在體內局部區得到這些效果的機制似乎至少部分涉及信號轉導方法，這裡dsRNA作用於血管壁周圍或近血管壁的細胞上，該方法導致波動過程從而引起在局部腔內形成介質。
實施例2本發明確定了該失配雙鏈RNA的唯一結構是實施本發明最有利的操作法。這是由於dsRNA的失配導致在相對穩定的dsRNA複合體內產生一個脆弱區其結果產生的dsRNA具生物活性的小片段更活躍，它可接近特定的體腔，在那裡產生局部的，高特異性的免疫調節和抗病毒作用。然而到達隔絕的體腔不是應用在本試驗大多數外源dsRNAs的性質。
在用於說明這個現象的其它試驗中，我們模仿生物降解的活體條件，通過將少量鹼基配對很好的ds RNA(poly I.polyC)及少量失配ds RNA(poly I.polyC U)暴露於S1核酸酶(ds RNA降解酶)，以比較之。兩者降解曲線定全不同，我們相信這種不同是針對非常不同的治療性質。poly I.poly C降解曲線是單特異性的，簡單地生成無生物活性的小的殘留核酸材料。而與其相反，失配ds RNA的降解曲線是雙相的在曲線的第一相，形成較小的有生物活性的片段;進來的母分子約為1000個鹼基對長，相對於沉降值(S2C，W)為11.0-15.0 S(用超速離心分析得到)，而子分子(部分水解)產物僅為50～100個鹼基對長。令人吃驚的是發現它們仍是有生物活性的，作為人的關鍵的2′-5′腺苷酸天然防禦途徑一些成分的細胞內催化劑。當在相似條件下將樣品poly I.C暴露於可觀量ds RNA降解酶如S1核酸酶時，沒有發現這些片段。
在失配dsRNA降解曲線第二相中收集到少於50個鹼基對的dsRNA片段。我們將這些片段命名為「抗核酸酶核」，但我們還不能將這種殘留片段與用polyI.polyC得到的殘留片段區分開。因此，我們的結論是當生物降解具特定構型的dsRNA(命名為失配dsRNA)時，得到了dsRNA特定的生物活性片段，而這些片段又有特殊的人們不期望的性質如它們可有效地進入系統循環或供血系統以外的體液(腔)內。這些腔包括但不限於各種漿膜和/或黏膜表面，諸如滑膜內壁，尿道表面，頸骨壁以及腦脊柱和眼液腔。
實施例3進行體外及體內試驗以證實這種在生物降解期間產生的新的dsRNA分子可使各種生物(體)液內天然防禦系統(例如，2′-5′腺苷酸系統)的介質達到意料之外的高水平。
A.核酸酶降解相對於失配dsRNAs的polyI.polyC用放射性poly I.poly C和失配ds RNA研究雙鏈RNA(ds RNA)對核酸酶水解的敏感性。[8-14C]多聚肌苷酸(SP.act.3.6μCi/μmole)購自P-L Brochemicals。這種標記的poly I長度大於1000對鹼基。將[8-14C]poly I與未標記poly I.poly C或失配ds RNA混合。將混合物加熱變性並重退火，從而得到放射性ds RNAs。
測定S核酸酶(E.C.3.1.30.1)的降解產物。S1核酸酶將降解單鏈核酸，剩下完整的雙鏈區。用S1核酸酶降解poly I.poly C以每分鐘得到1.4%溶於TCA的ds RNA的速率顯示單相動力學。加熱變性後，水解率達到每分鐘1.8%。
用標記的失配dsRNA作類似的試驗表明，其降解動力學為兩相的。天然的失配dsRNA開始有快速降解成分(每分鐘3.2%)，而後出現慢得多的降解成分(每次只降解0.5%)。變性的失配dsRNA顯示相對快速的降解(每分鐘4.5%)。
本試驗超過45分鐘的天然polyI.polyC和失配dsRNA總體降解是相似的。如前報導(Carter等J.Mol.Biol.，70∶567，1972)失配dsRNA水解率開始大於polyI.polyC.而失配dsRNA降解的兩相動力學說明這種材料與完全配對的polyI.polyC間有明顯的本質的不同。這些結果說明由於其二級或四級結構的明顯不同導致這些dsRNAs間對核酸酶敏感性的差異及意料之外的生物效應，這些效應在本申請中已報導。此外，一些dsRNA兩相成分間水解速率有6倍差異及水解慢的成分的相對低的水解都說明了這類不像是polyI.polyC的dsRNA存在一個相對抗核酸酶的核。
用標準組織培養基(RPMI1640)加10%熱失活的胎兒牛血清或人血清進行核酸酶降解失配dsRNA試驗。這種血清是核糖核酸酶的來源。用該培養基降解失配dsRNA是迅速的，在3分鐘內可使大約40%這種dsRNA成為TCA可溶的。進一步降解到2小時，也未得到更多量的降解物。系列稀釋培養基，再加失配dsRNA溫育3分鐘，在1/16稀釋的培養基中約有50%降解，再濃的血清也未見加強進一步降解。由於在相當長時間內和可觀的稀釋範圍內TCA可沉澱材料的量相對是穩定的，這種持久的穩定性可能不是由於TCA可溶材料的優先降解。這些結果再一次說明在失配dsRNA分子中有抗核酸酶核的存在。
B.失配dsRNA抗核酸酶核的分子量通過測定沉降係數來測定其分子量。將未處理的ds RNA樣品置於Becman E型超速離心機中在20℃下以48，000轉/分離心。每隔8分鐘測得5個點用來計算沉降係數。將ds RNA樣品在緩衝液A中(含0.15M Na Cl，0.01 M磷酸鈉，0.001 M Mg Cl2，pH7.2)稀釋到OD260為0.63。再將S1核取酶處理的ds RNA樣品(放在緩衝液A中OD260為0.65)在20℃下以52，000轉/分離心。用半高度和二次矩(half-height a and second moment)方法計算沉降係數。
用以上兩個方法計算的ds RNA沉降係數分別降為12.74和13.29。用S1核酸酶水解後，ds RNA沉降係數分別降為6.18和7.21。這些數據表明用S1核酸酶處理的失配雙鏈RNA降解成低分子量的片段。
C.dsRNA抗核酸酶核的生物活性用標準組織培養腫瘤生長抑制試驗測定S1核酸酶降解的ds RNA的生物活性。將ds RNA與S核酸酶一起溫育120分鐘，然後用來抑制人纖維肉瘤細胞株H I1080C14的生長。未處理的對照細胞生長百分數是用50μg/ml S1核酸酶降解的失配ds RNA處理72小時後得到的。未處理的ds RNA抑制細胞生長約為50%。用S1核酸酶處理失配ds RNA時，不管S1核酸酶對其降解的程度，均可見類似的抑制現象。熱變性結合S1核酸酶處理消除了失配ds RNA抗增殖作用。
這些結果說明既使延長核酸酶處理後仍可維持失配dsRNA的抗增殖活性。由於這個系統中降解的頭15～20分鐘內抗核酸酶核似乎仍在產生，稍後的時間內仍抑制生長說明dsRNA抗增殖活性是存在於抗核酸酶核之中，從而還可解釋為什麼在各種體腔內具生物活性的介質含量很高。
為進一步探索抗核酸酶核的生物活性，用S1核酸酶降解ds RNA60分鐘。取少部分用乙醇沉澱以有效地除去不能沉澱的小的降解物。為測定其生物活性，用200μg/ml天然ds RNA，S1核酸酶降解的Ampligen處理人神經膠質瘤細胞株A1235，再用乙醇沉澱，降解ds RNA。培養72小時後，Ampligen對A1235細胞的抑制為99.8%，S1核酸酶處理的Ampligen抑制78.4%，乙醇沉澱及S核酸酶處理的Ampligen抑制84.4%。各種處理均保持了ds RNA抗憎殖活性。
還測定了在這些A1235細胞株中這些製劑誘導2-5腺苷酸合成酶(ATP∶(2′，5′-寡(A)腺苷醯轉移酶(EC2.7.7.19))的能力。用PBS洗滌細胞沉澱，將其重懸在5ml溶胞緩衝液(20mM Tris，pH7.5，0.1mM EDTA，0.25M蔗糖，50mM KCl，2mM Mg Cl2和1m MDTT)置於冰上5分鐘。再用PBS洗兩次，將細胞沉澱物重懸於0.1ml緩衝液B(20mM HEPES，pH7.5，5mM Mg Cl2，120mMDTT和10%甘油)加0.5% Nonidet-P40，置於冰上10分鐘以溶胞。在8000g下離心6分鐘得到胞質萃取物，將其以50μl的小份貯存在-70℃。
2-5腺苷酸合成酶試驗見Suhadolnic等「Biochemistry 22∶4153(1983)。將融化的細胞萃取物(相當25μg的蛋白)與30μl市售的poly(r I).poly(r C)-瓊脂糖混合，在25℃下溫育20分鐘。用0.4ml緩衝液B洗兩次，除去未結合的蛋白。加入含2.5mM[-32P]ATP(0.12ci/mM)，2.5mM DTT，3單位/ml磷酸肌酸激酶和10mM磷酸肌酸的10μl緩衝液B開始酶促合成2′-5′-寡腺苷酸(2-5A)。30℃下溫育20小時，離心(8000g，25℃離心3分鐘)沉澱瓊脂糖。上清液中2-5A混合物根據Doetsh等人(Nature，291∶355，1981)所述方法用DEAE-纖維素柱層析分析。通過0.35M KCl緩衝液的柱洗脫物中放射活性量除以回收的總放射活性量計算出生成的產物。
沉澱後用ds RNA核酸酶處理過的ds RNA和核酸酶處理的ds RNA的無細胞萃取物加酶溫育合成2-5 A，表明時間對ATP轉化成2-5 A的作用。還有一些顯著的結果。首先，用未處理的失配ds RNA溫育無細胞萃取物18小時後，2-5 A合成酶的比活性為41.5。其次，在S1核酸酶處理後，ATP向2-5 A的轉化明顯增加。例如溫育18小時後，比活性為284，比用未處理的失配ds RNA所觀察的結果高約7倍。第三點，用S1核酸酶處理的ds RNA，再沉澱，12小時後2-5 A合成達最高值。這些數據說明在S1核酸酶處理失配ds RNA後使2-5 A的三聚體，四聚體及更高寡聚物酶促合成量明顯增加。隨著ds RNA尺寸的減小而酶活性增加說明是與變構修飾劑，即部分降解的失配ds RNA有關，失配ds RNA可結合到2-5 A合成酶上並使之活化，因而比未處理的失配ds RNA更好。這些發現的治療意義是明顯的。與此相反，當S1核酸酶處理的失配ds RNA低分子量降解物被沉澱除去後溫育12小時後最大限度合成2-5 A。沉澱後S1核酸酶降解的ds RNA使2-5 A合成酶達最大活性說明抗核酸酶核可以與溫育18小時後用S1核酸酶處理的失配ds RNA激活等同的方式激活2-5 A合成酶。
這些資料證實有生物活性的失配dsRNA片段的存在，並解釋了這些片段在生物體液中有治療活性的物質基礎。這些資料也說明生物活性片段比其母體化合物更具活性。
實施例4本發明另一個實施例是用其預防性傳染病，諸如細胞肥大病毒(CMV)(見N.Y.Times，July14，1988，PB6該文章概述了性病的發生)。細胞肥大病毒(皰疹病毒的一種)僅在美國就感染了一百萬以上的人，及有免疫系統缺陷的人常發生的胃腸絮亂或失明(無論是病毒感染的表面部分還是某個體腔都很難用抗病毒劑治癒)。CMV是性交傳播的，施用適量失配dsRNA(Ampligen)經過一段時間生成具生物活性的片段，就可高效抑制該病毒。例如圖3表示當將CMV暴露於Ampligen片段24小時時可100%抑制該病毒。當用相對無效的dsRNA時用表皮敷用的軟膏是不可能控制活性材料的釋放。
用細胞肥大病毒進行組織培養研究來說明dsRNA有生物活性片段在一段時間內的生成，有時稱之為巨細胞內涵病，即在用該病毒感染的增大的細胞內發現有核內內涵物。人細胞肥大病毒是與皰疹病毒有關的一種病毒。1988年在美國估計有一百萬人以上通過性感染這種CMV。感染通常不顯症狀，但對有免疫缺陷的人會導致胃腸絮亂和失明，新生兒對其特別敏感，因此CMV可導致流產，死產或產後死亡。(見TheMerkManual，14thEdition(1982)P205-206)對這種病無特異性治療方法。
在本試驗中，可用下列步驟和材料。
從新生兒分離人包皮成纖維細胞(HFF)，以低傳代(＜20代)保存在含Earle氏鹽補加有10%牛胎兒血清，2mML-穀氨醯胺，1mM丙酮酸鈉，20mMHEPES緩衝液和抗生素的基本培養基中。當細胞達到融合時，將其保存在含5%牛胎兒血清的上述培養基中。每周對細胞試驗一次使其沒受細菌和支原體的汙染。
整個試驗過程均用人細胞肥大病毒(CMV，ATCC＃VR-538，AD169株)。它包含HFF的第二代，它是在當75%宿主細胞被其感染時收集的。將無細胞的儲備病毒貯藏在試管中，保存於-120℃。細菌和支原體汙染試驗為陰性。在HFF細胞上測定CMV儲備製劑的感染效價，為4×106形成螢光內涵物/ml(見下)。
用冷凍乾燥的臨床用Ampligen
失配ds RNA;poly I.poly CU，Hem Research.Inc.，Rockvill，Maryland，USA)。根據生產者說明書來重配Ampligen，分成小份及貯存於-120℃。每個試驗取出一個小份，置於50℃水浴中轉動使其融化，再根據上述組織培養基的需要濃度來稀釋。
在不同條件下，用HFF細胞與藥物溫育，條件的變化包括(1)Ampligen濃度(2)供病毒攝取的Ampligen的順序;和(3)HFF暴露於Ampligen時間的長短。用臺盼藍排斥法測定結果Ampligen處理的HFF與未處理HFF活力基本一樣(即，＞99%)。
將融合的HFF放在一打蘭(容積3.7ml)殼型小瓶中在環狀蓋玻片上培養。用0.25ml適當稀釋度的CMV與殼形小瓶一起溫育開始感染細胞。
在37℃700xg轉速下使HFF暴露於CMV一小時使其攝取更多病毒。將小瓶洗2-3次除去細胞外病毒。然而向小瓶再加入1ml組織培養基，在常溫下溫育18-24小時，再在37℃溫育72小時。
用下列步驟測量CMV的複製加入100%丙酮固定HFF，從而中止了病毒繁殖。將含原有HFF的蓋玻片衝洗，並與抗CMV的小鼠單克隆抗體(Dupont)溫育，該抗體是對72千道爾頓即刻早期蛋白特異的。加入FITC標記的抗小鼠IgGF(ab)2(Sigma)探測結合的抗體。當用表螢光顯微鏡放大250倍時可見感染病毒的細胞顯示亮苯果綠核螢光。可在該顯微鏡下為CMV感染細胞計數(即這些細胞展示了螢光核內涵物)。將陽性儲備製劑在無Ampligen下稀釋，使其在溫育24小時後每蓋玻片上產生200-1200個CMV感染細胞。當感染倍數(MOI)為0.04時即可達到。
測定每個試驗條件下複製的蓋玻片上CMV內涵物平均數，比較沒接受Ampligen的正對照細胞。平行估計未暴露於Amplign或CMV的負對照細胞。根據下式表示Ampligen抗病毒活性CMV內涵物抑制%＝100%(( (有CMV內涵物平均數/用Ampligen處理HFF蓋玻片)/(有CMV內涵物平均數/未處理的HFF蓋玻片) )×100)Ampligen預處理時間長短對人包皮成纖維細胞感染細胞肥大病毒的影響表示在圖3。複製單層人包皮成纖維細胞或是(1)用10μg/mlAmpligen(開段)預處理的或是(2)用100μg/ml(斷段)在CMV攝取前特定時間間隔預處理的。
用所述IFA方法在病毒攝入後24時測定CMV感染程度。Ampligen處理培養物每蓋玻片上CMV內涵物平均數與未用藥處理的對照比較。結果說明Ampoligen預處理時間長短與CMV感染抑制程度成正比。當用Ampligen預處理HFF24小時時可達CMV抑制最大值。
此研究表明失配dsRNA抗CMV病毒感染效果隨時間而增強。CMV對失配dsRNA敏感性，時間，所用濃度，及相對無毒性dsRNA滯留釋放的水平本申請均未觸及。
權利要求
1.一種在人的局部化體腔內激活天然抗病毒途徑和裝備免疫系統的方法，該方法包括給需要接受這種治療的患者系統施用激活抗病毒途徑量的dsRNA，繼續進行上述系統給藥至少到測得人的槳液樣品中防禦介質增加為止。
2.權利要求1的方法，其中應在人患病之前或之後激活天然抗病毒途徑。
3.按照權利要求2的治療方法，其中疾病是病毒性的。
4.按照權利要求3的治療方法，其中病毒是皰疹科的一員。
5.按照權利要求3的治療方法，其中病毒是逆轉錄病毒科的一員。
6.按照權利要求5的治療方法，其中逆轉錄病毒是HIV。
7.權利要求6的方法，其中失配ds RNA是含有1∶5～1∶30尿嘧啶或鳥嘌呤鹼基的多聚肌苷酸和多聚胞苷酸的複合物，並優選r In·r(C12-14，U)n或r In·(C29，G)n。
8.治療在患者系統血液循環以外的局部化體腔內逆轉錄病毒皰疹科病毒感染的方法，所述方法包括給患者腸道外系統施用抗病毒有效量的失配dsRNA以使所給ds RNA的生物活性片段存在於患者體區的液體中，即存在於唾液，眼淚，漿液滲出液，漿液漏出物和/或腦脊髓液中。
9.權利要求8的方法，其中病毒是細胞肥大病毒。
全文摘要
腸道外系統施用dsRNA可使宿主介質釋放到各種區域化生物液體中以抵抗各種微生物，特別是病毒，從而降低各種微生物的傳染力和傳播，所說微生物與由性病瘤，皰疹和HIV引起的各種疾病有關。
文檔編號A61K31/70GK1032740SQ8810495
公開日1989年5月10日 申請日期1988年8月12日 優先權日1987年8月12日
發明者維裡曼·A·卡特 申請人:Hem研究公司