一種含有gb1蛋白融合標籤的快速克隆及表達質粒載體的製作方法

2023-05-14 07:40:56

專利名稱：一種含有gb1蛋白融合標籤的快速克隆及表達質粒載體的製作方法
技術領域：
本發明屬於分子生物學技術領域，具體涉及一種克隆及蛋白表達質粒載體，即一種含有GBl蛋白融合標籤的快速克隆及蛋白表達質粒載體。
背景技術：
傳統的克隆方法是通過將質粒載體同目的基因片段分別用相同的雙酶切消化後產生2-4個鹼基的粘性末端，利用連接酶將互補的粘性末端進行連接，隨後轉化大腸桿菌細胞，表達純化蛋白。由於粘性末端長度比較短，後續必須通過T4 DNA連接酶將載體和目的基因片段進行連接，並且在此過程中可能會有部分載體發生自連接。這種方法克隆基因 大約需要兩到三天時間。為了實現不依賴於連接酶的克隆方法，就需要構建一種更加方便有效的克隆載體。而且，目前市場上的商品化載體能夠利用的融合標籤也非常有限，將載體上設計的將目的蛋白同標籤分離的蛋白酶價格也都比較昂貴。基於上述幾方面的考慮，有必要提供一種帶有常用的融合蛋白標籤的快速克隆及蛋白表達載體。

發明內容
本發明的目的在於提供一種克隆及蛋白表達質粒載體，即一種在N端含有GBl融合蛋白標籤並且能夠將目的蛋白的基因進行快速克隆及蛋白表達的載體，從而彌補現有技術的不足。本發明的所述的質粒載體，包含有一段含有TEV酶識別位點的，用於編碼GBl蛋白的基因片段；兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。上述的GBl蛋白的核苷酸序列為SEQ ID NO: I。上述的兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID NO:2。本發明的載體，還包括有轉錄啟動子、轉錄終止子、卡那黴素編碼序列和複製子片段。本發明的載體，其遺傳圖譜如圖I所示,核苷酸序列為SEQ ID NO: 3。本發明構建的質粒載體用於在原核菌中表達重組蛋白。本發明構建的載體可以在不依賴於連接酶的情況下實現目的基因的快速高效克隆及蛋白表達。並且在載體中引入了 GBl融合蛋白標籤和TEV酶切位點，GBl融合蛋白標籤幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利於蛋白的分離純化；TEV酶識別序列位於GBl蛋白的基因序列的下遊，通過TEV酶對純化的蛋白質進行切割，可以將GBl蛋白標籤切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經濟適用的酶，從而極大地節約了實驗成本。


圖I :本發明的質粒載體PJM-GBI的遺傳圖譜；圖2 :重組蛋白pJM-GBI的表達純化蛋白圖譜；
其中M、PageRuler PrestainedProtein Ladder ;1、誘導前 BL21/pJM_GBl 的總蛋白；2、誘導後經超聲裂解並離心後的上清部分；3、誘導後經超聲裂解並離心後的沉澱部分；4、親和層析流穿液；5、20mM咪唑洗滌液；6、200mM咪唑洗脫液。
具體實施例方式本發明的載體以pET_24d為出發質粒，在構建過程中，分別加入了 GBl蛋白基因，TEV酶切位點以及GFP基因。在GFP基因兩側各引入了一個BsaI單酶切位點。一方面，通過BsaI單酶切，該載體被線性化並在線性化的片段兩側各產生5'端突出的4個鹼基的粘性末端，通過T4 DNA Polymerase及dTTP處理後，粘性末端的鹼基數各增加至10個和12個，利用該粘性末端，能夠方便快速將的目的基因克隆到該載體上並進行蛋白的表達純化。另一方面，為了更快，更方便的控制克隆質量，在克隆的酶切位點BsaI位點中間插入的GFP 基因，在後續篩選陽性克隆的過程中，能夠通過觀察是否產生綠色螢光，來判斷克隆基因是否插入到載體當中。下面對本發明的載體構建過程及應用進行詳細描述。一、表達質粒載體(pJM-GBl)的構建第一步，在pET_24d (購買自Novogen公司，編號69772-3)的多克隆位點的N端加上his-Tag-GBl標籤及TEV酶切位點。首先全序列合成his-tag-GBl-TEV，合成時在his-tag-GBl-TEV核酸序列的兩端分別加上XbaI和NcoI的酶切位點，再連接到克隆載體上(其中his-tag-GBI-Tag-TEV序列為SEQ ID NO: I)。製備的克隆質粒用XbaI和NcoI雙酶切後得到包含有his-Tag-GBl標籤的小片段，與pET-24d經過XbaI和NcoI雙酶切處理得到的載體進行連接，通過篩選得到N端帶有his-Tag-GBl標籤及TEV酶切位點的質粒，暫時命名為 pET-24d-GBl。第二步，將兩個BsaI酶切位點引入上述構建好的質粒pET-24d_GBl當中，取代其中的多克隆位點。設計引物引物合成時要求5』端經過磷酸化修飾上遊引物5』 -GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCACCACCACCAC-3 』下遊引物5』 -CGGTCTCATGGCGCCCTGAAAATAAAGATTCTC-3 』以pET-24d-GBl_Tag為模板進行擴增，PCR產物回收純化後利用T4連接酶連接，篩選得到帶有BsaI酶切位點的質粒pET-24d-GBl-2BsaI。第三步，根據GFP蛋白(SEQ ID NO: 2)的基因序列，合成BsaI-GFP-BsaI的核酸序列到克隆載體上。製備的克隆載體用BsaI酶切處理後得到的包含GFP的片段，與pET-24d-GBl-2BsaI經過BsaI酶切處理後的載體進行連接，得到最終的質粒pJM_GBl。製備的質粒pJM-GBl的遺傳圖譜如圖I所示，其核苷酸序列為SEQ ID NO:3。二、本發明質粒的應用效果檢測本發明提供的質粒載體在其GFP基因外側各包含一個BsaI的酶切位點(黑體表示)，該載體經BsaI單酶切去除GFP基因後，載體被線性化，並且在線性化的片段兩側各產生5』端突出的4個鹼基的粘性末端。BsaI酶切後的載體經過T4 DNA polymerse和dTTP處理，利用T4 DNA polymerse的3' —5'外切酶活性，可以去除3'端鹼基直到遇到T終止，由此質粒載體被線性化並且兩端的粘性末端鹼基數目增加至10個和12個。該粘性末端可以在不依賴於連接酶的情況下同互補鏈發生特異性的退火。
ATTTTCAGGGCGCCATGAGACCG.. .GFP. ■ .GGTCTCACCGCGTCGGGTCACCAC TAAAAGTCCCGCGGTACTCTGGC.. .GFP.. CCAGAGTGGCGCAGCCCAGTGGTG
h /I
V
ATTTTCAGGGCGCCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTCAGCCCAGTGGTG
T4 DNA polymerse +dTTP
V
ATTTTCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTTGGTG具體實驗步驟I. BsaI消化質粒載體配置混合體系5 μ g質粒載體2. 5 μ I BsaI (lOunits/ μ I)5 μ I 10ΧΝΕΒ buffer 3無菌水補齊到50 μ I5(TC 酶切 Ih。O. 8%瓊脂糖電泳檢測酶切效果，膠回收質粒載體片段。2. T4 DNA polymerse 處理質粒載體配置混合體系600ng BsaI消化後載體O. 5μ I dTTP(IOOmM)I μ I DTT(IOOmM)O. 2μ I 100XBSAO.4 μ I T4 DNA polymerse(3units/μ I)2 μ I 10ΧΝΕΒ buffer 2無菌水補齊到20 μ I22°C孵育 3Omin。75°C孵育 2Omin,滅活 T4 DNA polymerse。製備目的基因片段2. 2. I設計目的基因的引物 上遊引物CAGGGCGCCATG-目的基因下遊引物GACCCGACGCGGTTA_目的基因上下遊引物含有同質粒載體粘性末端互補的鹼基序列，上遊引物中含有ATG起始密碼子，下遊引物含有TAA終止密碼子。2. 2. 2 利用 T4 DNA polymerse 處理 PCR 產物利用設計好的引物，以目的基因為模板進行PCR擴增，擴增出來的產物回收後，利用T4 DNA polymerse和dATP處理，利用T4 DNA polymerse的3' —5'外切酶活性，可以去除3'端鹼基直到遇到A終止。
CAGGGCGCCATG...!丨的 ...TAACCGCGTCGGGTC GTCCCGCGGTAC.」11城W.. .ATTGGCGCAGCCCAG
^ 7 T4 DNA polymerse +dATP
CAGGGCGCCATG...目的基因...TAA
AC I 的 IM...ATTGGCGCAGCCCAG2. 3目的基因片段同載體進行快速連接
CAGGGCGCCATG... S 的基因...TAA
AC...目的基因...ATTGGCGCAGCCCAG
+
ATTTTCCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTTGGTG
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ATTTTCAGGGCGCCATG... 11 的 .. .TAACCGCGTCGGGTCACCAC
TAAAAGTCCCGCGGTAC... i I ^ W.. .ATTGGCGCAGCCCAGTGGTG取I. 5ml離心管，按照下面方法操作取I μ I處理好的質粒載體(25_50ng)，同2 μ I處理好的目的基因片段(O. 02pmol)混勻後置於22°C孵育5min。加入I μ I EDTA(25mM)，混合後置於22°C繼續孵育5min。利用本發明的質粒構建新的克隆，從PCR結束到連接的完成，僅僅需要Ih即可完成。而傳統的方法需要通過對目的基因片段進行雙酶切後再利用T4 DNA連接酶連接，一般需要Id時間。2. 4 轉化將連接產物轉化E. coli DH5a感受態細胞。2. 5鑑定陽性克隆通過菌落PCR方法鑑定陽性克隆，測序表明為目的陽性克隆。本發明所述的質粒載體轉化的宿主細胞為大腸桿菌細胞，最佳的大腸桿菌細胞為BL2U BL21(DE3)等。表達質粒pJM-GBl轉化入大腸桿菌BL21，用含有50 μ g/ml卡那黴素的LB培養基在37°C培養至0D600約為O. 6，加入終濃度為O. 3mM IPTG誘導，表達產物跑SDS-PAGE電泳。如圖2所示，第二泳道為目的蛋白的可溶性表達量，第六泳道為純化後的電泳結果；上述結果表明目的蛋白的可溶性表達量和純度都滿足實驗的需要。利用本發明構建的質粒成功的表達出一種蛋白質連接酶(SortaseA)的缺失體蛋白SortaseA (61_621)，可溶性效果很好。首先設計目的基因的引物上遊引物5』 -CAGGGCGCCAT GGCATATTTGT-3』 下遊引物 5』 -GACCCGACGCGGTTATT TGACTTCT-3』，以含有Sortase基因的質粒為模板進行PCR，PCR產物回收後利用BsaI進行酶切處理，與pJM_GBl載體連接，轉化E. coli DH5a ，篩選得到陽性克隆。將測序正確的質粒轉化E. coli BL21,IPTG誘導蛋白表達，利用鎳柱親和層析對該蛋白進行純化，通過TEV酶對純化的蛋白質進行切割，將GBl蛋白標籤切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經濟適用的酶，這也極大地節約了實驗成本。
權利要求
1.一種克隆及蛋白表達質粒載體，其特徵在於所述的質粒載體包含有 O一段含有TEV酶識別位點的，用於編碼GBl蛋白的基因片段； 2)兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。
2.如權利要求I所述的載體，其特徵更在於所述的編碼GBl蛋白的基因的核苷酸序列為 SEQ ID NO:I。
3.如權利要求I所述的載體，其特徵更在於所述的兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段，其核苷酸序列為SEQ ID N0:2。
4.如權利要求I所述的載體，其特徵更在於所述的質粒載體還包括有轉錄啟動子、轉錄終止子、卡那黴素編碼序列和複製子片段。
5.權利要求I所述的載體，其遺傳圖譜如圖I所示。
6.權利要求I所述的載體，其核苷酸序列為SEQID N0:3。
7.權利要求I所述的載體用於在原核菌中高效表達重組蛋白。
全文摘要
本發明涉及一種克隆及蛋白表達質粒載體，包含有一段含有TEV酶識別位點的，用於編碼GB1蛋白的基因序列和兩側帶有BsaI酶切位點的GFP基因片段。本發明構建的載體可以在不依賴於連接酶的情況下實現目的基因的快速高效克隆及蛋白表達。並且在載體中引入了GB1融合蛋白標籤和TEV酶切位點，GB1融合蛋白標籤幫助增加難溶解蛋白的溶解度，利於蛋白的分離純化；TEV酶識別序列位於GB1蛋白的基因序列的下遊，通過TEV酶對純化的蛋白質進行切割，可以將GB1蛋白標籤切除，得到天然的目的蛋白。TEV酶是目前最經濟適用的酶，從而極大地節約了實驗成本。
文檔編號C12N15/63GK102827858SQ201210336689
公開日2012年12月19日 申請日期2012年9月12日 優先權日2012年9月12日
發明者鄒培建, 蓋園明, 趙普亞, 秦剛 申請人:天津工業生物技術研究所