環境中常見微生物pcr檢測技術的前處理方法
2023-05-14 15:33:21
專利名稱：環境中常見微生物pcr檢測技術的前處理方法
技術領域：
本實發明涉及一種微生物的處理方法，具體涉及的是微生物PCR檢測技術的前處
理方法。
背景技術：
在最近的研究中，通過PCR檢測不同種類的微生物，對微生物進行直接定性測試已經是常見的研究方法，尤其是環境中常見的細菌等微生物，都需要對菌體進行24小時培養，整體檢測時間需要I 2天。環境中常見的微生物有葡萄球菌屬、鏈球菌屬、沙門菌屬、志賀菌屬、霍亂、弧菌、 大腸桿菌等致病菌以及一些無致病功能的菌體。尤其是在牲畜養殖場的環境中，大腸桿菌、沙門菌屬、葡萄球菌屬等是最常出現的菌群，這些菌群出現在溫血動物腸道中引起腸黏膜細胞水與電解質的代解紊亂，是導致幼畜腹瀉的主要病因之一。這些菌群在牲畜中主要的傳染途徑是通過食入了被汙染的飼料所致，由於養殖業的特點，飼料都是散放於養殖的環境中的，所以對環境中，特別是牲畜養殖場中的致病菌的及時、準確的檢測就顯得非常重要。聚合酶鏈式反應技術(Polymerase chain reaction, PCR)是近年來分子生物學領域中迅速發展和廣泛應用的一種技術，能夠快速、準確地在體外上百萬倍的擴增目的基因或DNA片段。現在應用的PCR技術能在48h內實現對環境中常見致病菌的快速、準確檢測， 結果與鑑別培養沒有明顯差異；但是在應對突發性病變時，這種技術需要依靠細菌培養和 DNA的提取，操作較複雜，耗時長。而且在PCR擴增過程中，樣本中含有大量雜質，且細菌量在不同樣本中的差別明顯，直接檢測可能出現嚴重的假陰性情況，幹擾實驗結果。同時，樣本中DNA的質量在PCR檢測中非常重要，除菌群濃度高低外，緩衝液中離子濃度也會對DNA 的質量造成影響，從而直接影響PCR的擴增結果。
發明內容
本發明提供一種無需經過DNA提取即可進行PCR檢測，且可減少檢測所需時間、簡化檢測步驟、提高PCR檢測效率的環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法。為了實現上述目的，本發明的技術方案如下
環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，主要由以下步驟構成
(1)獲得樣本；
(2)過濾將樣本用雙蒸水混勻後過濾，過濾後的液體再用濾紙過濾，得到過濾液；
(3)離心將過濾液於8500Xg 12000Xg的離心條件下離心；
(4)洗滌離心後的沉澱用磷酸鹽緩衝液洗滌；
(5)稀釋採用磷酸鹽緩衝液對洗滌後的沉澱進行稀釋，稀釋後菌液濃度不小於 I. 5X 103CFU/ml，稀釋後的菌液即進行PCR檢測。進一步，所述常見微生物為革蘭氏陰性菌、葡萄球菌、鏈球菌或菌肺炎雙球菌。
為了更好的實現本發明，所述磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 05M O. 2M。作為一種優選，所述樣本米自養殖場環境中。作為最優的實施方式，所述步驟(5)中稀釋後菌液濃度不小於3. 12X103CFU/ml。本發明與現有技術相比，具有以下優點及有益效果
(1)本發明處理後獲得的菌液，無需再經過培養基培養和DNA提取的過程，可直接進行 PCR檢測，簡化了檢測步驟，減少實驗所需時間，可在4小時內獲得檢測結果；
(2)本發明處理後的菌液與其他方法處理後的菌液相比，當其進行PCR檢測時，其檢測效率明顯提聞；
(3)本發明採用8500Xg 12000Xg的離心條件離心，可保證有效的分離出致病菌；
(4)本發明採用雙重過濾以及緩衝液洗滌沉澱的方法，可基本排除樣本中影響PCR反應的影響因子，使檢測結果更準確；
(5)本發明中稀釋後的菌液濃度不小於I.5X103CFU/ml，保證有效的檢測出擴增條帶， 使檢測的結果更準確；
(6)本發明採用濃度為O.05M O. 2M的磷酸鹽緩衝液，有效避免磷酸鹽緩衝液中的離子對DNA的質量造成影響。
圖I為樣本中大腸埃希菌的PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。圖2為純的大腸埃希菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。圖3為樣本熱裂解法PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。圖4為樣本細菌漂浮法PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。圖5為樣本增菌後PCR擴增樣本敏感性比較1%凝膠電泳圖。圖6為樣本中豬霍亂沙門氏菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。圖7為樣本中金黃色葡萄球菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。圖8為樣本中鏈球菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖
圖9為樣本中菌肺炎雙球菌PCR擴增產物1%凝膠電泳圖。
具體實施例方式下面結合附圖和實施例對本發明作進一步說明，但本發明的實施方式不限於下列實施例。實施例I
本實施例主要由以下步驟構成
(I)獲得樣本；即確定樣本，本發明的樣本為養殖場中的糞便，該樣本採自四川省洪雅市兩個不同的肉豬養殖場。(2)過濾將樣本用雙蒸水混勻後過濾，過濾後的液體再用濾紙過濾，得到過濾液； 即樣本用雙蒸水溶解，震蕩混勻後，用鋼網將混合物中的渣滓過濾掉，過濾後的液體再採用雙層濾紙過濾，得到過濾液。(3)離心本實施例採用9000Xg的離心速度，對過濾液進行離心，離心的時間為 4min。
(4)洗滌離心後的沉澱用磷酸鹽緩衝液洗滌；本步驟中磷酸鹽緩衝液採用的濃度為O. 1M，洗滌的次數為2次。(5)稀釋採用磷酸鹽緩衝液對洗滌後的沉澱進行稀釋，稀釋後菌液濃度不小於1.5X103CFU/ml，稀釋後的菌液即進行PCR檢測。在本實施例中，Ig樣本提取出的菌體沉澱採用30ul的磷酸鹽緩衝液對其進行稀釋。經檢測，稀釋後濃度菌液濃度不小於 I. 5X103CFU/ml。PCR檢測步驟
將13ul的MixDNA聚合酶、Iul的引物、Iul的菌液和IOul的ddH20的混合液加入到 PCR擴增儀中進行PCR擴增。以擴增後的產物作為樣品，對10個樣品進行檢測，檢測結果如圖I。該引物的濃度為10pmol/ul,該MixDNA聚合酶採用天根生化科技有限公司 (tiangen)生產的 2x Taq MasterMix。本實施例PCR檢測所採用的反應條件為941預變性41^11，941變性45s，55°C退火40s，72°C延伸45s，循環30次。擴增後產物用I. 0%的凝膠進行電泳。根據檢測的菌種不同，檢測該菌種時所採用的引物也就不相同，引物採用的是本領域的技術人員公知的可檢測出該菌種的引物。本實施例以檢測腸毒素大腸桿菌為目的， 具體檢測的是大腸埃希菌，該菌的純菌購自中國獸醫藥品監察所國家獸醫微生物菌種保藏管理中心，保藏編號為CVCC197。本實施例所採用的引物與大腸埃希菌相匹配。對照實驗
I、純的大腸埃希菌的敏感度的檢測取大腸埃希菌的純菌，用牛肉膏培養基作為稀釋液，梯度稀釋後，檢測在10' 10_3，10_5，10_7，10_9濃度下，分別取10_5，10_7，10_9進行菌液塗板，每個稀釋度平行塗3板，37°C培養24小時後進行菌落計數，計算出細菌原液濃度。對菌液採用直接PCR反應，計算出檢出限；即分別取不同稀釋濃度下的大腸埃希菌的菌液Iul為模版，在IO-1，10Λ 1(Γ5，10' IO-9的濃度下進行PCR擴增，擴增後檢測結果見圖2。2、細菌熱裂解法取樣本lg，用5ml濃度為O. IM的磷酸鹽緩衝液溶解該樣本，震蕩混勻30s，使用過濾鋼網簡單過濾雜質，過濾後所得液體煮沸5分鐘，500Xg的條件下離心4min，取上清液。用lul、5ul、10ul分別進行PCR檢測。本對照例中進行檢測的樣品數為十個，該十個樣本中包括Iul的樣本3個、5ul的樣本4個、IOul的樣本3個，檢測結果如圖3。3、細菌漂浮法取樣本lg，20ml雙蒸水溶解，震蕩混勻30s。在500Xg的條件下離心4min，取上清於新的50ml無菌離心管中，重複操作二次。在9000Xg的條件下離心4 分鐘，棄上清液，收集沉澱。收集的菌體用30ml濃度為O. IM的磷酸鹽緩衝液懸浮，9000 X g 離心、洗滌2次，洗淨的菌體懸浮在3 ml的TE Buffer中，用槍吹打後渦旋振蕩均勻，本對照例中，以振蕩均勻後的菌體作為樣品進行PCR檢測。樣品數為十個，檢測結果如圖4。4、直接檢測對照取樣本lg，用Iml的磷酸鹽緩衝液溶解，充分混勻後，分別取 lul、5ul、10ul的混勻液作為樣品進行PCR檢測分析。本對照例中樣品數為十個，該十個樣本中包括Iul的樣本3個、5ul的樣本4個、IOul的樣本3個。5、增菌後PCR擴增樣本敏感性檢測取樣本lg，用Iml的磷酸鹽緩衝液溶解，取IOul溶解後的標準樣本,加入到5ml牛肉膏培養基中，培養16小時後，取培養後的液體 Iul作為樣品進行PCR擴增檢測。本對照例中樣品數為6個，檢測結果如圖5。結果分析
如圖I所示，通過本發明處理後的10個樣本，有6個樣本檢測出目的條帶，通過2次 PCR檢測，發現依然有6個樣本能出現目的條帶。說明本發明能達到實驗檢測大腸埃希菌的目的，通過2次過濾，洗滌，可有效將影響PCR反應的影響因子基本排除。如圖2所示，圖中從左到右擴增條帶的濃度順次為10'10'10'10'ΚΓ1，濃度為10_7的擴增條帶後均出現了與理論值大小相符條帶(487bp)。其結果表明在10_7，也就是每毫升菌液濃度達到3. 12X103 CFU/ml時，能擴增出理論相符的條帶。即該方法的敏感性可達 I. 5X103CFU/ml。如圖3所示，在細菌熱裂解法中對10個樣本進行了 PCR檢測分析，在反應模版分別為lul，5ul，10ul的情況下，只在2個樣本中出現了與理論值大小相符的目的條帶，該目的條帶均出現在模版為5ul時。經過2次PCR反應，在另一個樣本的5ul條件下也出現了目的條帶。實驗部分檢出條帶，說明此方法可以分離出菌體，具有一定的效果。同樣的樣本， 5ul能檢測出結果，而IOul無法檢測出，說明菌液中存在其他物質，該物質是導致檢驗結果出現假陰性的主要原因。此方法在結果準確性方面與檢測的需求差距較大，樣本中存在某些物質可能對PCR擴增結果存在有較大幹擾。如圖4所示，通過細菌漂浮法處理的10個樣本，經過PCR擴增、電泳檢測後發現均沒有目的條帶出現，後通過超速離心進行菌體富集，將3ml的結果通過高速離心，將細菌重新用30ul體積的磷酸鹽緩衝液漂浮，在3個樣本中檢測出了目的條帶，二次PCR沒有新的結果出現。有上述結果可知此方法對菌體損耗大，大量細菌在處理過程中丟失，菌體濃度無法達到實驗檢測要求。在直接檢測對照中，直接對照檢測的10個樣本，擴增後都未出現目的條帶。說明 其中的某些因素，嚴重影響PCR反應的條件，出現假陰性結果。如圖5所示，所得的6個樣本在PCR擴增後都能取得清晰一致的目的條帶，與本發明一致，說明本發明的方法符合檢測的目的需求，在檢出限範圍內，能獲得預期的結果。實施例2
本實施例與實施例I的不同點在於樣本的選擇、離心條件以及檢測的菌種。本實施例中樣本選擇為散放於養殖場環境中的飼料，離心條件採用8500 X g，檢測的菌種為豬霍亂沙門氏菌。該豬霍亂沙門氏菌為革蘭氏陰性菌。其PCR檢測結果如圖6。實施例3
本實施例與實施例I的不同點在於樣本的選擇、離心條件以及檢測的菌種。本實施例中樣本選擇為養殖場環境中的墊料，離心條件採用9500Xg，檢測的菌種為金黃色葡萄球菌。其PCR檢測結果如圖7。實施例4
本實施例與實施例I的不同點在於樣本的選擇、離心條件以及檢測的菌種。本實施例中樣本選擇為養殖場環境中的生活汙水，離心條件採用9300Xg，檢測的菌種為鏈球菌。
其PCR檢測結果如圖8。實施例5
本實施例與實施例I的不同點在於樣本的選擇不同，樣本的選擇、離心條件以及檢測的菌種。本實施例中樣本選擇為養殖場周邊的土壤，離心條件採用8800Xg，檢測的菌種為菌肺炎雙球菌。其PCR檢測結果如圖9。在圖6 圖9中，目的條帶均被檢測出，根據以上檢測結果，則可有效的證明使用本發明所述的前處理方法處理後，環境中常見微生物均能夠有效的被檢測出來。按照上述方法，便可很好地實現本發明。
權利要求
1.環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，其特徵在於，主要由以下步驟構成(1)獲得樣本；(2)過濾將樣本用雙蒸水混勻後過濾，過濾後的液體再用濾紙過濾，得到過濾液；(3)離心將過濾液於8500Xg 12000Xg的離心條件下離心；(4)洗滌離心後的沉澱用磷酸鹽緩衝液洗滌；(5)稀釋採用磷酸鹽緩衝液對洗滌後的沉澱進行稀釋，稀釋後菌液濃度不小於I.5X103CFU/ml ;稀釋後的菌液即進行PCR檢測。
2.根據權利要求I所述的環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，其特徵在於 所述常見微生物為革蘭氏陰性菌、葡萄球菌、鏈球菌或菌肺炎雙球菌。
3.根據權利要求2所述的環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，其特徵在於 所述磷酸鹽緩衝液的濃度為O. 05M O. 2M。
4.根據權利要求3所述的環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，其特徵在於 所述樣本米自養殖場環境中。
5.根據權利要求2或3或4所述的環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，其特徵在於所述步驟(5)中稀釋後菌液濃度不小於3. 12X103CFU/ml。
全文摘要
本發明公開了環境中常見微生物PCR檢測技術的前處理方法，本發明主要由以下步驟構成(1)獲得樣本；(2)過濾將樣本用雙蒸水混勻後過濾，過濾後的液體再用濾紙過濾，得到過濾液；(3)離心將過濾液於8500×g～12000×g的離心條件下離心；(4)洗滌離心後的沉澱用磷酸鹽緩衝液洗滌；(5)稀釋採用磷酸鹽緩衝液對洗滌後的沉澱進行稀釋，稀釋後菌液濃度不小於1.5×103CFU/ml；稀釋後的菌液即進行PCR檢測。本發明具有無需經過DNA提取即可進行PCR檢測、可減少檢測所需時間、簡化檢測步驟、提高PCR檢測效率等優點。
文檔編號C12R1/42GK102605087SQ20121009000
公開日2012年7月25日 申請日期2012年3月30日 優先權日2012年3月30日
發明者葉勇剛, 廖黨金, 曹冶, 李江凌, 王秋實, 羅丹丹, 謝晶, 趙素君 申請人:四川省畜牧科學研究院