一種用於抗衰老的細胞製劑的製備方法與流程
2023-05-05 10:34:36
本發明屬於細胞製劑技術領域，特別是涉及一種用於抗衰老細胞製劑的製備方法。
背景技術：
中國正快速步入老齡化社會，目前中國歲以上老年人有約億。預計2050年中國60歲以上老年人將佔三成，老齡化帶來的種種困擾和問題更加嚴重。衰老和死亡是任何物種的個體都難以避免的最終結局,但至今我們對衰老發生機制的理解還相當有限。鑑於其重要性,衰老一直是生物學研究的熱點。
骨髓間充質幹細胞,是來源於胚胎發育早期中胚層的一類多能幹細胞,是全身結締組織的幹細胞。大量實驗證實在合適的體外分化條件下,不僅可以分化為成骨細胞、脂肪細胞、軟骨細胞、內皮細胞、肌肉細胞等間質細胞,而且可以跨胚層分化為外胚層的神經元、神經膠質細胞和內胚層的肝細胞。並且具有移植後不發生排斥反應的特點。隨著對的深入研究,目前認為除了具有多向分化潛能,還能在損傷局部反應性分泌多種神經營養因子。
技術實現要素：
本發明的目的在於提供一種用於抗衰老細胞製劑的製備方法，通過將骨髓間充質幹細胞分離培養，並將體外培養的骨髓間充質幹細胞加入到生理鹽水中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑，該細胞製劑能夠改善衰老大鼠各組織細胞形態的損傷，具有一定的逆轉衰老損傷的作用。
本發明是通過以下技術方案實現的：
一種用於抗衰老細胞製劑的製備方法，按照如下步驟進行：
步驟(1)、配製骨髓間充質培養液；
步驟(2)、無菌條件下，將抽取的骨髓加入至無菌培養瓶中，培養瓶中加入所述步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液，體積比為1:1，用無菌移液器充分吹散骨髓細胞，製得骨髓細胞懸液；
步驟(3)、將所述步驟(2)中得到的骨髓細胞懸液離心後棄上清液，得到骨髓幹細胞群；
步驟(4)、取所述步驟(4)中得到的骨髓幹細胞群加入所述步驟(1)中配置的培養液中重懸後過濾，將過濾後含有骨髓幹細胞群的培養液以1×109個/mL接種於培養皿中培養；
步驟(5)、原代培養24-48h後第一次換液，之後每3d換液一次，第三次換液12-18h後以1:2比例傳代培養；
步驟(6)、取所述步驟(5)中培養的第三代骨髓間充質幹細胞加入到生理鹽水中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑。
進一步地，步驟(1)中所述骨髓間充質培養液為L-DMEM培養基中加入青黴素濃度為100U/mL，加入鏈黴素濃度為100U/mL。
進一步地，所述步驟(3)中離心速率為800-1500r/min，離心時間為5-10min。
進一步地，所述步驟(4)中用70μm無菌尼龍過濾器。
進一步地，步驟(4)中將所述培養基置於37℃、CO2飽和溼度培養箱中培養。
進一步地，所述步驟(6)中骨髓間充質幹細胞濃度為(2-5)×107個/mL。
本發明具有以下有益效果：
本發明方法通過將骨髓間充質幹細胞分離培養，並將體外培養的骨髓間充 質幹細胞加入到生理鹽水中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑，結果發現該細胞製劑能夠改善衰老大鼠各組織細胞形態的損傷，具有一定的逆轉衰老損傷的作用，為研究骨髓間充質幹細胞抗衰老機制，以及人體抗衰老研究提供線索。
當然，實施本發明的任一產品並不一定需要同時達到以上所述的所有優點。
具體實施方式
本發明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有作出創造性勞動前提下所獲得的所有其它實施例，都屬於本發明保護的範圍。
本發明為一種用於抗衰老的細胞製劑，該方法具體步驟如下：
實施例1
步驟(1)、於L-DMEM培養基中加入青黴素濃度為100U/mL、鏈黴素濃度為100U/mL，配製成骨髓間充質培養液；
步驟(2)、無菌條件下，用步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液衝洗大鼠骨髓腔，將衝出的的骨髓加入至無菌培養瓶中，培養瓶中加入步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液，體積比為1:1，用無菌移液器充分吹散骨髓細胞，製得骨髓細胞懸液；
步驟(3)、將步驟(2)中得到的骨髓細胞懸液以800r/min離心5min，棄上清液，得到骨髓幹細胞群；
步驟(4)、取步驟(4)中得到的骨髓幹細胞群加入步驟(1)中製得的培養液中重懸後用70μm無菌尼龍過濾器過濾，將過濾後含有骨髓幹細胞群的培養液以1×109個/mL接種於5cm×5cm培養皿中，置於37℃、CO2飽和溼度培養箱中培養；
步驟(5)、原代培養24h後第一次換液，之後每3d換液一次，第三次換液12h後以1:2比例傳代培養；
步驟(6)、取步驟(5)中培養的第三代骨髓間充質幹細胞加入到生理鹽水中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑，其中，骨髓間充質幹細胞濃度為2×107個/mL；
步驟(7)、將步驟(6)中製備的骨髓間充質幹細胞製劑通過尾靜脈注射輸注進入小鼠體內以達到抗衰老的目的。
實施例2
步驟(1)、於L-DMEM培養基中加入青黴素濃度為100U/mL、鏈黴素濃度為100U/mL，配製成骨髓間充質培養液；
步驟(2)、無菌條件下，用步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液衝洗大鼠骨髓腔，將衝出的的骨髓加入至無菌培養瓶中，培養瓶中加入步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液，體積比為1:1，用無菌移液器充分吹散骨髓細胞，製得骨髓細胞懸液；
步驟(3)、將步驟(2)中得到的骨髓細胞懸液以1500r/min離心10min，棄上清液，得到骨髓幹細胞群；
步驟(4)、取步驟(4)中得到的骨髓幹細胞群加入步驟(1)中製得的培養液中重懸後用70μm無菌尼龍過濾器過濾，將過濾後含有骨髓幹細胞群的培養液以1×109個/mL接種於5cm×5cm培養皿中，置於37℃、CO2飽和溼度培養箱中培養；
步驟(5)、原代培養48h後第一次換液，之後每3d換液一次，第三次換液18h後以1:2比例傳代培養；
步驟(6)、取步驟(5)中培養的第三代骨髓間充質幹細胞加入到生理鹽水 中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑，其中，骨髓間充質幹細胞濃度為5×107個/mL；
步驟(7)、將步驟(6)中製備的骨髓間充質幹細胞製劑通過尾靜脈注射輸注進入小鼠體內以達到抗衰老的目的。
實施例3
步驟(1)、於L-DMEM培養基中加入青黴素濃度為100U/mL、鏈黴素濃度為100U/mL，配製成骨髓間充質培養液；
步驟(2)、無菌條件下，用步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液衝洗大鼠骨髓腔，將衝出的的骨髓加入至無菌培養瓶中，培養瓶中加入步驟(1)中配置的骨髓間充質培養液，體積比為1:1，用無菌移液器充分吹散骨髓細胞，製得骨髓細胞懸液；
步驟(3)、將步驟(2)中得到的骨髓細胞懸液以1200r/min離心7min，棄上清液，得到骨髓幹細胞群；
步驟(4)、取步驟(4)中得到的骨髓幹細胞群加入步驟(1)中製得的培養液中重懸後用70μm無菌尼龍過濾器過濾，將過濾後含有骨髓幹細胞群的培養液以1×109個/mL接種於5cm×5cm培養皿中，置於37℃、CO2飽和溼度培養箱中培養；
步驟(5)、原代培養36h後第一次換液，之後每3d換液一次，第三次換液15h後以1:2比例傳代培養；
步驟(6)、取步驟(5)中培養的第三代骨髓間充質幹細胞加入到生理鹽水中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑，其中，骨髓間充質幹細胞濃度為3×107個/mL；
步驟(7)、將步驟(6)中製備的骨髓間充質幹細胞製劑通過尾靜脈注射輸 注進入小鼠體內以達到抗衰老的目的。
本發明方法通過將骨髓間充質幹細胞分離培養，並將體外培養的骨髓間充質幹細胞加入到生理鹽水中重懸，製得骨髓間充質幹細胞製劑，結果發現該細胞製劑能夠改善衰老大鼠各組織細胞形態的損傷，具有一定的逆轉衰老損傷的作用，為研究骨髓間充質幹細胞抗衰老機制，以及人體抗衰老研究提供線索。。
以上內容僅僅是對本發明所作的舉例和說明，所屬本技術領域的技術人員對所描述的具體實施例做各種各樣的修改或補充或採用類似的方式替代，只要不偏離發明或者超越本權利要求書所定義的範圍，均應屬於本發明的保護範圍。