一種促進裂殖壺菌產油脂的方法與流程

2023-04-30 05:00:21

本發明屬於運動鞋用材料技術領域，具體涉及一種促進裂殖壺菌產油脂的方法。

背景技術：

多不飽和脂肪酸(polyunsaturatedfattyacids，pufas)在人體中具有重要的作用，如：維持細胞膜結構和功能，降低膽固醇和甘油三酯等功能。pufas分為omega-6(或ω-6)和omega-3(或ω-3)兩個系列，大多數人可以從膳食中獲得足夠的ω-6pufa，但可能缺乏適量的ω-3pufa。ω-3pufa系列中的二十碳五稀酸(eicosapentaenoicacid，epa)和二十二碳六稀酸(docosahexaenoicacid，dha)因為對人體重要作用而引起廣泛的關注(comprehensivereviewsinfoodscience&foodsafety，2010，9(6)：655-675；internationalfoodresearchjournal，2011，18：493-499；marinedrugs，2013，11(7)：2259-81)。epa對心血管系統具有良好作用，尤其是在治療動脈硬化、高血脂、精神分裂症等方面尤為顯著(processbiochemistry，2005，40：3627-3652)。dha又被稱為「腦黃金」，具有促進大腦發育、降血脂、降血壓、保護視力、防止老年痴呆等方面具有重要作用(中國油脂，2016，41(5)：60-64)。

傳統pufas主要從魚油中獲得(marinedrugs，2013，11(7)：2259-81)，但是由於漁業中過度捕撈和海水汙染等問題，魚油產量和食品安全性等問題制約著ω-3pufa產量的發展。近20年來，利用微海洋微生物產ω-3pufa的方法日益興起(journalofnutritionalscience，2015，4)。其中裂殖壺菌(schizochytriumsp.)為一種海洋真菌，由於其生長速度快、易於培養、胞內ω-3pufas含量高等特點而成為目前工業化生產pufas的主要菌株(生物加工工程，2013，11(5)：21-25)。

目前，針對裂殖壺菌進行傳統的培養條件和培養方法的優化，裂殖壺菌產油脂量佔生物量只有50％左右(中國海洋大學學報(自然科學版)，2007，37(2)：293-29；)，仍然較低，為了更好地應用於實際生產提高裂殖壺菌產油量則十分關鍵。

在裂殖壺菌傳統優化培養基的基礎上添加外源物有以下幾種如：芝麻素(lipids，1991，26(7)：512-516)、薑黃素(biosciencebiotechnologyandbiochemistry，2000，64(8)：1641-5)以及辣椒素(biosciencebiotechnologyandbiochemistry，2001，65(8)：1859-1863)，但是這類物質在代謝過程中抑制油脂的去飽和。尋找對油脂積累有積極作用的外源添加劑對將裂殖壺菌應用於工業生產十分必要，苯甲酸對位衍生物這一類外源物中包含很多物質，其中如葉酸和對氨基苯甲酸，他們都是b族維生素中的一種，葉酸對微生物具有十分重要的作用，它是生化反應中一碳單位轉移酶系的輔酶，是一碳單位的重要受體和供體(農產品加工·學刊，2006(5)：31-35；四川食品與發酵，2003(04))，並作為甲基供體參與細胞內的甲基化反應(chinesejournalofcancer，2003，22(6)：668-671)，對氨基苯甲酸是葉酸的組成部分之一，而對甲苯甲酸和苯甲酸鈉都是對氨基苯甲酸的結構類似物，他們都可能有促進裂殖壺菌產油脂的作用。

技術實現要素：

本發明的目的在於克服現有技術缺陷，提供一種促進裂殖壺菌產油脂的方法。

本發明的技術方案如下：

一種促進裂殖壺菌產油脂的方法，在裂殖壺菌的發酵培養基中一次添加終濃度為100mg/l～3g/l的苯甲酸對位衍生物，添加苯甲酸對位衍生物的時機為發酵培養開始至發酵培養結束前1～2d中的任意時間。

在本發明的一個優選實施方案中，所述苯甲酸對位衍生物包括苯甲酸鈉、對甲基苯甲酸、葉酸和對氨基苯甲酸。

在本發明的一個優選實施方案中，包括如下步驟：

(1)將保存在甘油管中的裂殖壺菌接入18～22ml的種子培養基中，接種量為2～10％，於20～30℃的溫度及150～200rpm的轉速下，培養24～48h，獲得一級種子；

(2)將上述一級種子接入18～22ml的種子培養基中，接種量為2～10％，於20～30℃的溫度及150～200rpm的轉速下，培養24～48h，獲得二級種子；

(3)將二級種子接入45～55ml的發酵培養基中，接種量為2～10％，於20～30℃的溫度及150～200rpm的轉速下，培養4～7dh，期間擇機一次加入苯甲酸對位衍生物，以發酵生產多不飽和脂肪酸，得發酵液，添加苯甲酸對位衍生物的時機為發酵培養開始至發酵培養結束前1～2d中的任意時間；

(4)對上述發酵液中的油脂進行提取和純化。

進一步優選的，所述種子培養基的ph為6～8，配方為：葡萄糖30g/l、酵母抽提物10g/l、硫酸鈉12g/l、氯化鉀0.5g/l、硫酸鎂2g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸銨1g/l、二水合氯化鈣0.17g/l。

進一步優選的，所述發酵培養基的ph為6～8，配方為：葡萄糖90g/l、穀氨酸鈉5g/l、固體玉米將乾粉5g/l、硫酸鈉12g/l、氯化鉀0.5g/l、硫酸鎂2g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸銨1g/l、二水合氯化鈣0.17g/l、七水合硫酸鋅3mg/l、六水合氯化鈷0.04mg/l、五水合硫酸銅2mg/l、六水合硫酸鎳2mg/l、七水合硫酸鐵10mg/l、泛酸鈣3.2mg/l、四水合氯化錳3mg/l、二水合鉬酸鈉0.04mg/l、維生素b19.5mg/l、維生素b120.15mg/l。

進一步優選的，所述步驟(4)包括如下步驟：

1)準確吸取適量發酵液於1具塞試管中，混勻後再加入適量濃鹽酸，於60～70℃水浴加熱40～50min至菌體消化完全；

2)再加入適量正己烷，加塞充分搖勻，靜置分層，取上層有機相置於已恆重的磨口錐形瓶中，用正己烷重複洗滌3～5次，直至上層有機相無色；

3)通過氮吹的方法除去有機溶劑至恆重，計算總油脂產量。

本發明的有益效果：本發明的通過在發酵培養基中添加適量苯甲酸對位衍生物中的苯甲酸鈉相較於裂殖壺菌在原始培養基中油脂產量提高了32.12％，添加對甲基苯甲酸油脂產量提高了38.21％，葉酸的添加使油脂產量提高了56.84％，對氨基苯甲酸使油脂產量提高了66.51％，但這類物質的添加對ω-3pufa並無抑制作用。

附圖說明

圖1為本發明實施例1中不同苯甲酸鈉濃度下裂殖壺菌發酵液中油脂的變化量曲線圖。

圖2為本發明實施例2中不同對甲基苯甲酸濃度下裂殖壺菌發酵液中油脂的變化量曲線圖。

圖3為本發明實施例3中不同葉酸濃度下裂殖壺菌發酵液中油脂的變化量曲線圖。

圖4為本發明實施例4中不同對氨基苯甲酸濃度下裂殖壺菌發酵液中油脂的變化量曲線圖。

圖5為本發明實施例4中的脂肪酸的分析鑑定結果。

具體實施方式

以下通過具體實施方式結合附圖對本發明的技術方案進行進一步的說明和描述。

下述實施例中，種子培養基的ph為6～8，配方為：葡萄糖30g/l、酵母抽提物10g/l、硫酸鈉12g/l、氯化鉀0.5g/l、硫酸鎂2g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸銨1g/l、二水合氯化鈣0.17g/l；發酵培養基的ph為6～8，配方為：葡萄糖90g/l、穀氨酸鈉5g/l、固體玉米將乾粉5g/l、硫酸鈉12g/l、氯化鉀0.5g/l、硫酸鎂2g/l、硫酸鉀0.65g/l、磷酸二氫鉀1g/l、硫酸銨1g/l、二水合氯化鈣0.17g/l、七水合硫酸鋅3mg/l、六水合氯化鈷0.04mg/l、五水合硫酸銅2mg/l、六水合硫酸鎳2mg/l、七水合硫酸鐵10mg/l、泛酸鈣3.2mg/l、四水合氯化錳3mg/l、二水合鉬酸鈉0.04mg/l、維生素b19.5mg/l、維生素b120.15mg/l。

實施例1

(1)將保存在甘油管中的裂殖壺菌atcc1381(來源於美國atcc菌株保藏中心)接入裝有20ml種子培養基的100ml搖瓶中，接種量為2％～10％，在20～30℃的搖床中，以150～200rpm的轉速，培養24～48h，獲得一級種子；

(2)將一級種子接入裝有20ml種子培養基的100ml搖瓶中，接種量為2％～10％，在20～30℃的搖床中，以150～200rpm的轉速，培養24～48h，獲得二級種子；

上述種子培養基的ph為6～8，其中含有碳源、氮源、磷源、硫源、玉米漿粉、酵母粉、硫酸銨和穀氨酸鈉，碳源為葡萄糖，氮源包括有機氮源和無機氮源，磷源為磷酸二氫鉀或磷酸氫二鉀，硫源為硫酸鎂或硫酸銨；

(3)將二級種子接入裝有50ml發酵培養基的250ml搖瓶中，接種量為2％～10％，在20～30℃的搖床中，以150～200rpm的轉速，培養7d，期間擇機一次加入苯甲酸鈉，以發酵生產多不飽和脂肪酸，得發酵液，添加苯甲酸鈉的時機為發酵培養開始至發酵培養結束前1～2d中的任意時間，

上述苯甲酸鈉的添加方法如下：將苯甲酸鈉溶於水配成100×～1000×濃縮液，通過0.22μmmce的濾膜過濾除菌後，取適量加入發酵培養基，使其終濃度為0～4g/l；

(4)分別取第4～7d的發酵液測不同苯甲酸鈉濃度下總油脂的含量，並對脂肪酸進行分析鑑定，具體結果如圖1所示；

總油脂含量的測定方法如下：

1)準確吸取3ml發酵液於10ml具塞試管中，混勻後再加入4ml質量分數為38％的濃鹽酸。於60～70℃水浴加熱40～50min至菌體消化完全；

2)再加入3～5ml正己烷，加塞充分搖勻，靜置分層，取上層有機相置於已恆重的磨口錐形瓶中。用正己烷重複洗滌3～5次，直至上層有機相無色；

3)通過氮吹的方法除去有機溶劑至恆重，計算總油脂(totalfattyacid，tfa)產量。

分析鑑定的具體方法如下：

1)準確稱取一定量(約0.1g)的步驟(4)所得的油脂，置於50ml磨口錐形瓶中，加入5ml的0.5mol/l的koh-ch3oh溶液於65℃水浴回流至油滴消失(大約10min)，從冷凝管頂部加入5ml30％的三氟化硼乙醚反應30min；

2)冷卻後加入5ml正己烷振蕩，加入適量內標物(如十七烷酸甲酯)然後加入足量的飽和食鹽水，靜置分層後取上層正己烷相併加入無水硫酸鈉脫水，過濾，所得樣品即可進行氣象色譜分析；氣象色譜條件：選用sp2560色譜柱(avondale，pennsylvania)(30m*0.25mm*0.25m)，採用程序升溫：初始溫度100℃，然後按20℃/min升溫到180℃，再按15℃/min升溫至220℃，保持20min；柱壓13.582psi，進樣口溫度250℃，fid檢測器溫度260℃。

實施例2

添加的苯甲酸對位衍生物為對甲基苯甲酸，添加方法如下：將對甲基苯甲酸溶於無水乙醇配成100×～1000×濃縮液，通過0.22μmpvdf的濾膜過濾除菌後，取適量加入發酵培養基，使其終濃度為0～3g/l，分別取第4～7d的發酵液測不同對甲基苯甲酸濃度下總油脂的含量，並對脂肪酸進行分析鑑定，其餘同實施例1，具體結果如圖2所示。

實施例3

添加的苯甲酸對位衍生物為葉酸，添加方法如下：將葉酸溶於無水乙醇配成100×～1000×濃縮液，通過0.22μmpvdf的濾膜過濾除菌後，取適量加入發酵培養基，使其終濃度為100mg/l～3g/l，分別取第4～7d的發酵液測不同葉酸濃度下總油脂的含量，並對脂肪酸進行分析鑑定，其餘同實施例1，具體結果如圖3所示。

實施例4

添加的苯甲酸對位衍生物為對氨基苯甲酸，添加方法如下：將對氨基苯甲酸溶於鹼性水配成100×～1000×濃縮液，通過0.22μmmce的濾膜過濾除菌後，取適量加入發酵培養基，使其終濃度為100mg/l～3g/l，分別取第4～7d的發酵液測不同對氨基苯甲酸濃度下總油脂的含量，並對脂肪酸進行分析鑑定，其餘同實施例1，具體結果如圖4和圖5所示。

由上述實施例可知，本發明的方法發酵培養基中添加適量苯甲酸對位衍生物中的苯甲酸鈉相較於裂殖壺菌在原始培養基中油脂產量提高了32.12％，添加對甲基苯甲酸油脂產量提高了38.21％，葉酸的添加使油脂產量提高了56.84％，對氨基苯甲酸使油脂產量提高了66.51％，但這類物質的添加對ω-3pufa並無抑制作用。

以上所述，僅為本發明的較佳實施例而已，故不能依此限定本發明實施的範圍，即依本發明專利範圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發明涵蓋的範圍內。