一種用於乳腺癌診斷的基因的製作方法
2023-04-22 21:26:41 1
專利名稱：一種用於乳腺癌診斷的基因的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種分泌型差異人乳腺球蛋白質(hMAM)，特別是涉及一個缺失三個胺基酸的hMAM新的剪接體，一種用於乳腺癌診斷的基因。
背景技術：
現已發表的有關乳腺癌腫瘤標誌物有癌胚抗原(CEA)、鐵蛋白、乳清蛋白、人絨毛膜促性腺激素、唾液酸轉移酶、整合蛋白家族、CD44、尿激酶型纖溶酶原激活物、血栓致敏蛋白、p53基因及蛋白產物、c-erbB-2基因產物、降鈣素、CA-549、CA-153、CK-20、BRCA1和BRCA2基因等。這些標誌物分別存在於細胞、血液和體液中，對早期乳腺癌的診斷有一定的價值，但其特異性不強，不能用為確診乳腺癌的指標，故難以應用這些腫瘤標誌物建立乳腺癌的免疫診斷方法。2002年3月美國Coria生物技術公司用cDMA削減雜交和基因蕊片技術證實，hMAM是乳腺癌的特異高表達基因。由於乳腺組織供血豐富，乳腺癌癌細胞浸潤血管並沿血路轉移是乳腺癌轉移的一種主要模式。故hMAM一經報告，國內外學者競相利用逆轉錄聚合鏈式反應(RT-PCR)技術檢測乳腺癌患者外周血hMAMmRNA的水平，探討hMAM診斷乳腺癌的價值。不同的作者報導的hMAM在乳腺癌患者中的檢出陽性率不同，平均為80％，在幾乎所有的報導中，正常健康人外周血中均不能查出hMAM。亦有報告無症狀的早期乳腺癌患者hMAM檢出為陽性後，進一步的病理活檢證實為I、II期乳腺癌患者。RT-PCR雖然為一種敏感的檢測基因表達方法，但存在一定比例的假陽性和假陰性，此外，RT-PCR操作步驟多，又需要高性能的基因擴增儀，難以在乳腺癌普查中廣泛應用。國際癌症研究資料表明，I、II、III期乳腺癌的5年生存率分別為80％、52％、42％和14％。這充分說明乳腺癌早期發現、早期診斷、早期治療直接影響著治療效果。
發明內容
本發明的目的在於提供一種有很高的特異性，不存在假陽性和假陰性的用於乳腺癌診斷的基因。
本發明一種用於乳腺癌診斷的基因，是一個缺失三個胺基酸的hMAM新的剪接體，它是從乳腺癌組織中利用差式篩選和cDNA末端擴增(RACE)及逆轉錄聚合鏈式反應RT-PCR技術，在上皮細胞中克隆出一個分子量10KD的分泌型差異人乳腺球蛋白質(hMAM)，它是一個缺少三個胺基酸的hMAM新的前接體，其基因序列如下1 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 61 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaat gtctaagact 121 gaatacaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 181 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgagcaatta 241 atatatgaca gcagtctttg tgatttattt taa。
本發明一種用於乳腺癌診斷的基因，具有很高的特異性，不存在假陽性和假陰性，可用來建立新的特異性乳腺癌免疫診斷方法，以及以單克隆抗體為基礎建立一種新的乳腺癌免疫顯像診斷試劑。利用上述兩種方法可以用來診斷早期乳腺癌、乳腺癌的轉移、術前確定手術範圍、術後檢查復發。
具體實施例方式
本發明一種用於乳腺癌診斷的基因的製備方法是1)取乳腺癌手術患者的血清標本，差式篩選，cDA末端擴增擴和逆轉錄聚合鏈式反應RT-PCR克隆hMAM全長cDNA。
2)將其亞克隆入含EcoRI/SalI酶切位點的pGEX-1GST融合表達載體，異丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)誘導表達。
3)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺(SDS-PAGE)蛋白電泳測定GST-hMAM蛋白表達水平。
4)GST親和柱法純化hMAM，即得到該基因。經西安第四軍醫大學測序分析，其基因序列如上所述。純度達95％。
本發明一種用於乳腺癌診斷的基因診斷乳腺癌應用實例。診斷方法分別取已確診的乳腺癌患者、確診的非乳腺惡性腫瘤患者及正常人的血清標本各30例，經逆轉錄聚合鏈式反應RT-PCR克隆hMAM全長的cDNA，分別與本發明進行比較，檢測基因表達的水平。
診斷結果表明1)非乳腺惡性腫瘤患者及正常人的血清標本中該基因均呈陰性，陰性率100％。
2)原發性乳腺，轉移性乳腺癌患者的血清標本中該基因呈陽性，陽性率100％。
3)沒有發現假陽性及假陰性的結果。
4)說明該基因在乳腺癌患者的組織中具有特異性的表達。
權利要求
1.一種用於乳腺癌診斷的基因，是從乳腺癌組織中利用差式篩選和cDNA末端擴增及逆轉錄聚合鏈式反應RT-PCR技術，在上皮細胞中克隆出的一個分子量10KD的分泌型差異人乳腺球蛋白質hMAM，其特徵在於是一個缺失三個胺基酸的hMAM新的剪接體，基因序列如下1 atgaagttgc tgatggtcct catgctggcg gccctctccc agcactgcta cgcaggctct 61 ggctgcccct tattggagaa tgtgatttcc aagacaatca atccacaagt gtctaagact 121 gaatacaaaag aacttcttca agagttcata gacgacaatg ccactacaaa tgccatagat 181 gaattgaagg aatgttttct taaccaaacg gatgaaactc tgagcaatgt tgagcaatta 241 atatatgaca gcagtctttg tgatttattt taa。
全文摘要
本發明提供一種用於乳腺癌診斷的基因，是從乳腺癌組織中利用差式篩選和cDNA末端擴增及逆轉錄聚合鏈式反應RT－PCR技術，在上皮細胞中克隆出的一個分子量10KD的分泌型差異人乳腺球蛋白質(hMAM)，是一個缺失三個胺基酸的hMAM新的剪接體。利用該基因可建立一種新的特異性乳腺癌免疫診斷方法，同時，以單克隆抗體為基礎建立一種新的乳腺癌免疫顯像診斷試劑。從而用於診斷早期乳腺癌，乳腺癌的轉移，術前確定手術範圍，術後檢查復發。
文檔編號C12P19/34GK1482252SQ0311722
公開日2004年3月17日 申請日期2003年1月23日 優先權日2003年1月23日
發明者趙利軍 申請人:趙利軍