酶引導晶體生長增強拉曼光譜表面效應檢測雙酚A的方法與流程

2023-04-23 05:29:26 3

本發明屬於檢測領域，具體地，涉及一種雙酚a的表面增強拉曼光譜檢測方法。

背景技術：

近年來，食品安全問題嚴重危害人類健康，已經引起了人們的廣泛關注。由於表面增強拉曼散射光譜(sers)具有低檢測限、窄光譜帶寬等獨特優勢，特別是納米材料學的發展，使得sers在食品安全檢測領域的應用逐年增多。同傳統紅外光譜法相比，sers技術不僅能提供被檢測物詳細的結構信息，同時由於水分子的拉曼散射截面小，從而可以忽視背景從水相體系中直接有效地獲得生物分子的振動信息進而檢測生物分子，甚至其檢測限可達單分子水平。由於sers具有低檢測限、窄光譜帶寬、螢光猝滅能力和無光學標籤使用限制等諸多優點，使得sers廣泛應用於食品安全檢測、dna/rna分析及檢測、遺傳學和蛋白質組學、醫療診斷和化學試劑檢測等。在上述的研究背景下，本發明將引用基於高增強因子金/銀納米材料的sers技術在食品安全檢測方法方面開展工作，以目前常見的導致食品安全問題的物質雙酚a(bpa)為研究對象，建立具有高靈敏度和高特異性的檢測新方法，拓寬拉曼光譜技術在食品安全檢測領域的應用範圍，建立新型簡單、快速靈敏的檢測方法來滿足食品安全檢測領域日益增長的檢測需求。

分子的拉曼散射是一種非彈性的散射過程，其散射截面約為10-29cm2/分子。同其他光學過程如螢光(10-19cm2/分子)的橫截面相比，拉曼散射是一種很弱的現象，這導致常規拉曼散射在測量低濃度分子時一般都存在嚴重的缺陷(尤其是背景螢光比較突出的時候)。雖然已有許多科研者對sers技術在食品安全檢測中的應用進行了研究，但同其他檢測技術(如常規光譜檢測技術、色譜檢測技術和生物檢測技術等)一樣，sers技術的應用仍有很大的局限性。比如大部分sers基底增強效應偏低、sers檢測模式不夠多樣化等缺陷，這些因素導致sers技術在食品安全檢測領域的應用主要集中於定性分析，在定量方面尚未成為人們依賴的檢測手段。因此建立應用於食品安全檢測領域的基於sers的新型定量方法仍十分迫切。

酶引導晶體成長策略是以酶作為一種高效的催化劑催化底物產生還原劑，可通過還原劑還原金屬離子(主要是au3+/ag+)並沉積在納米粒子表面。因此，通過酶來引導控制晶體生長過程，協調其物理化學性質，並決定晶體納米結構的形狀和大小。基於結合酶的高效催化特性和金屬沉積物的高靈敏spr-響應，因此對於酶-引導銀沉積的研究更為廣泛。雖然酶-引導銀沉積已被應用於多種方法中，但目前還沒有人將其應用於sers傳感器設計。

技術實現要素：

針對本領域存在的不足之處，本發明提出一種酶引導晶體生長增強拉曼光譜表面效應檢測雙酚a的方法，利用適配體互補鏈(dna2)與信標4-硝基苯硫酚(4-ntp)功能化的auns為sers探針，建立一種基於葡萄糖氧化酶酶-引導晶體生長策略的超靈敏檢測目標物雙酚a的sers方法，拓寬sers的檢測模式及範圍。

實現本發明目的的技術方案為：

一種酶引導晶體生長增強拉曼光譜表面效應檢測雙酚a的方法，包括步驟：

(1)適配體(aptamer；apt)與葡萄糖氧化酶(gox)偶聯物的製備：適配體溶液和葡萄糖氧化酶、偶聯劑的溶液混合，製備適配體與葡萄糖氧化酶偶聯物(apt-gox)溶液；所述偶聯劑為4-(n-馬來醯亞胺甲基)環己烷-1-羧酸磺酸基琥珀醯亞胺酯鈉鹽；

(2)auns的製備：通過向haucl4溶液中加入檸檬酸三鈉，獲得au種的溶液；將au種的溶液加入到haucl4溶液中，同時迅速加入抗壞血酸(aa)和agno3溶液，室溫孵化直至溶液由淺紅變為墨綠色。

(3)功能化auns的製備：向步驟(2)製備的auns溶液中加入與所述巰基化的適配體互補的dna2溶液，再加入4-硝基苯硫酚(4-ntp)乙醇溶液，常溫振蕩孵化10～15h，通過固液分離除去多餘的dna2和4-硝基苯硫酚，沉積物復溶於超純水中。

(4)auns-gox探針的製備：向步驟(3)得到的功能化auns溶液中加入適配體與葡萄糖氧化酶偶聯物(apt-gox)溶液，再加入不同濃度的雙酚a標準樣品溶液。常溫孵化後，固液分離，固體物復溶於2-(n-嗎啉)-乙磺酸(mes)緩衝液中。我們將這種混合物命名為auns-gox探針溶液。

(5)auns的ag殼生長；

向步驟(4)得到的auns-gox探針溶液中加入葡萄糖溶液，孵化1h後加入agno3，常溫孵化2h後測定表面增強拉曼散射sers信號。

其中，步驟(1)中，取0.1～0.3m巰基化的適配體溶液和(0.5～2)×10-5m葡萄糖氧化酶溶液、(1～10)×10-4m偶聯劑的溶液混合，適配體溶液、葡萄糖氧化酶溶液、偶聯劑溶液的體積比為1:100:(20～40)。

本發明優選技術方案之一為，步驟(1)中，所述巰基化的寡核苷酸溶液通過以下方法得到：巰基化的寡核苷酸溶解於ph為7.5～8.5的緩衝液中，配成100μm的溶液，再加入20～40倍體積的15mm三(2-羧乙基)膦鹽酸鹽溶液(tcep)在20～30℃下孵化1～3h，4℃保藏。所述緩衝液為tris、hcl、edta、吐溫、磷酸鹽中的一種或多種配製而成。

其中，步驟(1)中，所述葡萄糖氧化酶、偶聯劑溶液是：濃度為1×10-5m的葡萄糖氧化酶，濃度為5×10-4msulfo-smcc偶聯劑在ph7.4的pb緩衝液中配製，然後孵化30～50min。

其中，步驟(2)中，au種的溶液濃度為10～20nm，haucl4溶液濃度為0.1～0.5mm，au種加入到haucl4溶液後，迅速加入濃度為0.1m抗壞血酸(aa)和1mm的agno3溶液，au種溶液、haucl4溶液抗壞血酸、agno3溶液體積比為0.1～0.3：20：0.05～0.2：0.05～0.2。

進一步地，步驟(3)中，先向auns溶液中加入濃度為50～200μm的dna2溶液，常溫振蕩孵化3h，再加入1mm的4-ntp乙醇溶液，auns溶液、dna2溶液，4-ntp乙醇溶液的體積比為1000：0.5～3：1～10。

其中，步驟(4)中，向功能化auns溶液中加入10-13g/ml適配體與葡萄糖氧化酶偶聯物(apt-gox)，再加入濃度為0、10-18g/ml～10-12g/ml系列濃度的雙酚a標準樣品溶液。

固體物復溶於的2-(n-嗎啉)-乙磺酸(mes)緩衝液可以為10mm，ph5.9的緩衝液。步驟(4)常溫孵化的時間可以是7～10h。

其中，步驟(5)具體為：向auns-gox探針溶液中加入100mm葡萄糖溶液，孵化1h後加入0.1mm的agno3和40mm氨水溶液，常溫孵化測定表面增強拉曼散射sers信號，

其中，拉曼檢測的激發波長為50～820nm，測定1300～14001339cm-1處的sers峰為4-ntp的特徵峰。具體可以是激發波長為785nm，1339cm-1處的sers峰為4-ntp的特徵峰。

更進一步地，所述方法還包括操作：構建表面增強拉曼散射sers信號和雙酚a標準樣品溶液濃度的數學關係；對未知雙酚a含量的樣品進行同樣檢測，求得樣品中雙酚a含量。

本發明方法具有以下優點：

本發明成功製備了一種基於auns檢測雙酚a的超靈敏sers傳感器。首次將酶-引導晶體生長策略應用於構建sers生物傳感器。建立了目標物濃度與sers特徵峰信號強度之間的線性關係，檢測限低至10-16g/ml，低於目前報導的多數方法，可實現食品安全中雙酚a的超靈敏檢測。

本發明的關鍵在於使用銀原子沉積於金納米星表面作為拉曼-活性基底，相比於常規的aunps和agnps，靈敏度更高；與其他的基於酶-引導晶體生長策略方法相比，如：比色法(紫外-可見光譜法)相比(檢測限4.9×10-11g/ml)，本方法使用的sers具有更高的靈敏度。

本發明結合葡萄糖氧化酶催化反應和auns-沉積銀殼的放大效果，進一步提高了本傳感器的靈敏度。

附圖說明

圖1為auns在晶體生長前(圖1之a)和晶體生長後(圖1之b)的透射電鏡圖；

圖2為auns在不同狀態時的動態光散射(dls)分布圖，

圖3為4-ntp在不同狀態時的sers光譜，

圖4之a為添加不同濃度bpa時4-ntp的sers光譜；圖4之b為bpa檢測的標準曲線，

圖5為基於酶-引導銀沉積的sers傳感器超靈敏檢測bpa原理示意圖。

具體實施方式

以下實施例用於說明本發明，但不用來限制本發明的範圍。

除非特別說明，本發明所採用的技術手段，為本領域常規的技術手段。

本發明涉及的巰基化的適配體dna1、dna2為

適配體apt(dna1):5-sh-(t)10-ccggtgggtggtcaggtgggatagcgttccgcgtatggcccagcgcatcacgggttcgcacca-3′

互補鏈dna(dna2):5-sh-(t)10-cccacctgaccacccaccgg-3′。

實施例1

(1)適配體與葡萄糖氧化酶(apt-gox)偶聯物的製備

巰基化的寡核苷酸首先溶解於te緩衝液(10mmtris-hcl，1mmedta，ph8.0)中，配成1μl100μmdna溶液，再加入30μl15mmtcep溶液，25℃下孵化2h，4℃儲存備用。

之後，1ml1×10-5mgox和300μl5×10-4msulfo-smcc偶聯劑加入到磷酸鹽緩衝液(pbs，12mm，ph7.4)中孵化45min，多餘的sulfo-smcc偶聯劑通過離心過濾管(ultracel-30k薄膜，密理博)離心過濾除去再加入10μl5×10-5m的適配體溶液，25℃下孵化2h，多餘的適配體通過離心過濾管(ultracel-100k薄膜，密理博)離心過濾除去。apt-gox溶液(濃度約為1×10-5m)製備完成。

(2)金納米粒子(auns)的製備

auns採用兩步種子-介導生長法合成，包括12nmau種的製備和auns的形成。

12nmau種是通過在不斷攪拌的條件下向100ml沸騰的haucl4溶液(1mm)中加入15ml1％檸檬酸三鈉溶液，繼續攪拌15min，冷卻至室溫，4℃保藏。

auns的形成是在輕微攪拌的條件下將200μl12nmau種加入到20ml0.25mmhaucl4(含20μl1mhcl，ph3.0)溶液中，同時迅速加入100μl0.1m的aa和200μl1mm的agno3溶液。室溫孵化30s，直至溶液由淺紅變為墨綠色。在3000rpm/min的轉速下離心15min，棄去上清液，底物復溶於超純水中來阻止還原反應的進行。auns溶液在4℃的冰箱中短期保藏。

(3)功能化金納米粒子的製備

功能化金納米粒子探針是通過au-s鍵法製備的。先向1ml新鮮的auns溶液中加入1μl100μm的dna2溶液，常溫振蕩孵化3h。隨後，再加入5μl1mm4-ntp乙醇溶液，繼續常溫振蕩孵化12h。以3000rpm/min的轉速離心兩次，每次10min以除去多餘的dna2和4-ntp，沉積物復溶於超純水中。

(4)檢測體系的構建

向上述功能化auns探針中加入一定量的apt-gox溶液(6.7×10-16m)，常溫震蕩孵化5min，得auns-gox探針溶液；

向上述auns-gox探針溶液中加入500μl葡萄糖溶液(100mm)，孵化1h後加入100μlagno3(0.1mm)和100μl氨水(40mm)，常溫孵化2h後測sers信號。圖2中標記為ag@auns。

auns-gox探針溶液分別加入不同濃度的bpa標準樣品溶液(0，10-18g/ml～10-12g/ml，參見圖4)。常溫孵化8h後，在2500rmp/min的轉速下離心10min，棄去上清液，底物復溶於2-(n-嗎啉)-乙磺酸(mes)緩衝液(10mm，ph5.9)中。再加入葡萄糖溶液(100mm)，孵化1h後加入agno3(0.1mm)和氨水溶液(40mm)，常溫孵化2h後測sers信號。

激發波長為785nm，測定1339cm-1處的sers峰為4-ntp的特徵峰。

圖1示出auns在晶體生長前(圖1之a適配體功能化的納米星)和加入apt-gox溶液晶體生長後(圖1之b組裝後生長晶體的納米星)的透射電鏡圖，可觀察到銀沉積在auns表面，sers基底的粒徑與生長前相比星形變得不明顯，星狀分枝不突出，且粒徑增加。

圖2示出了金納米粒子(auns)、auns-dna探針(第(2)步所制)、auns-gox探針(步驟(4)制)、ag@auns的動態光散射(dls)分布圖，由圖可知.auns在不同狀態時的dls分布基本都呈正態分布，新合成的auns的平均水和粒徑約為43.46nm；auns修飾了互補鏈dna2和4-ntp形成的auns探針(auns-dna探針)的平均水和粒徑約為48.63nm，dna2與apt-gox偶聯物雜交後形成的auns-gox探針的平均水和粒徑約為77.29nm，通過這三組的比較可以證明auns探針和auns-gox探針的產生。更重要的是，晶體生長後形成的auns-ag核-殼納米結構(ag@auns)的平均水和粒徑約為83.05nm，進一步說明生成的金屬銀可沉積在auns表面。

圖3為4-ntp在不同狀態時的sers光譜，由圖可知，晶體生長前4-ntp的特徵峰值較弱(2000以下)，而晶體生長後4-ntp的特徵峰值很強。以加入10-16g/mlbpa為例，此時4-ntp的特徵峰值強度約為晶體生長前峰值的9倍；而當加入的bpa濃度為10-13g/ml時，4-ntp的特徵峰值強度約為晶體生長前峰值的3倍。

圖4之a為添加不同濃度bpa時4-ntp的sers光譜；圖4之b為bpa檢測的標準曲線，相關係數r2為0.9901，說明檢測準確、檢測限低至10-16g/ml。

本方法結合sers的高靈敏性和酶-引導晶體成長策略的高效性，設計了一種新的基於酶-引導銀沉積的sers傳感器用於bpa分子的超靈敏檢測，首次證明了酶-引導晶體生長策略在構建高靈敏基於納米材料的sers傳感器方面的前景。

參見圖5的原理圖，該傳感器的核心機理是利用葡萄糖氧化酶(gox)催化葡萄糖產生過氧化氫，而過氧化氫可將硝酸銀還原為金屬銀並使之沉積在納米金星(auns)表面，此過程可顯著增強拉曼信號。當體系中不存在bpa時，apt-gox偶聯物能與auns探針上的互補dna2鏈雜交，從而致使auns探針上含大量gox，此時體系中存在auns-gox探針，因此通過gox催化反應產生過氧化氫並將硝酸銀還原為金屬銀沉積在auns表面，auns表面「熱點」越多，sers信號越強。當體系中存在bpa時，apt-gox偶聯物與bpa結合，不能與互補dna2鏈雜交，體系中不存在auns-gox探針，因此不能產生金屬銀沉積在auns表面，此時sers信號較弱。也就是說，隨著bpa加入量的增大，體系中存在auns-gox探針的量越少，gox催化反應的強度減弱，還原產生的金屬銀會減少，因此沉積在auns表面的銀殼會變薄，此時sers信號會隨之變弱。結合這種酶-引導銀沉積的高靈敏性和適配體的高特異性，本方法實現了對bpa高靈敏和特異性檢測。

雖然，上文中已經用一般性說明及具體實施方案對本發明作了詳盡的描述，但在本發明基礎上，可以對之作一些修改或改進，這對本領域技術人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發明精神的基礎上所做的這些修改或改進，均屬於本發明要求保護的範圍。

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長沙理工大學

酶引導晶體生長增強拉曼光譜表面效應檢測雙酚a的方法

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