一種納米基因導入材料的製作方法
2023-04-22 20:44:56 1
專利名稱：一種納米基因導入材料的製作方法
技術領域：
本發明涉及一種基因導入材料
背景技術：
基因導入系統或方法可以分為兩類病毒型基因導入系統，以逆轉錄病毒、腺病 毒、腺相關病毒為載體；非病毒型基因導入，如顯微注射、基因槍、磷酸鈣共沉澱、陽離子脂 質體法、以及新興的納米基因導入材料。由於病毒型基因導入系統存在許多嚴重的不足，如 病毒轉染有可能激活原癌基因等，故非病毒型轉染方式是目前的研究熱點，在上述非病毒 式轉染中，顯微注射一次只能處理一個細胞；基因槍穿透力十分有限；磷酸鈣共沉澱法結 果不穩定；僅陽離子脂質體法表現了良好的轉染效率，但是過高的毒性又限制了它的應用。
發明內容
針對現有技術的缺點，本發明的目的是提供一種納米基因導入材料，具有良好的 細胞相容性、低毒、穩定且較高的轉染效率。為了實現上述目的，本發明的技術方案為一種納米基因導入材料，由HAuCl4和 N-[3-(三甲氧基矽基)丙基]-1，2-乙二胺為原料合成AuNPs/氨基矽烷納米球複合材料， 其中HAuCl4與N-[3-(三甲氧基矽基)丙基]-1，2-乙二胺的比率為1 4。與現有技術相比，本發明具有以下的優越性(1)具有較高的轉染效率，在人血管 平滑肌細胞中可以達到40%左右；(2)低毒性，因AuNPs/氨基矽烷納米的複合材料具有良 好的生物相容性，細胞生存率很高；C3)材料分散性良好，符合對轉染的要求；(4)非常低的 成本，氨基是食品添加劑，成本很低，另外實驗中使用的化學藥品，氨水都是常見廉價試劑；材料製備反應簡單易操作，可重複性好。
圖1為AuNPs/氨基矽烷納米的掃描電鏡圖片。圖2為AuNPs/氨基矽烷納米的投射電鏡圖片。圖3為轉染後的倒置螢光顯微鏡下的螢光圖片。圖4為轉染後的細胞生存率圖片。圖5為轉染效率圖。
具體實施例方式一、材料的製備1、主要材料四水合氯金酸(HAuCL4 · 4H20)，N, N- 二甲基甲醯胺(DMF)為分析純，為上海國藥 集團化學試劑有限公司生產。N-[3_(三甲氧基矽基)丙基]-1，2-乙二胺為Alfa Aesar, 公司生產，純度為90%。所有試劑使用前沒有進行進一步的純化。
2、材料的製備IOmL具塞錐形瓶中加5mL DMF，加50微升0. IM HAuCl4水溶液加3. 6微升SiEN， 攪拌均勻後放入60°烘箱中加熱20h。冷至室溫後，產品離心(15000rpm，5min)Jt0H洗3次。二、結合性能的測定1、主要材料綠色螢光蛋白質粒(pEGFP-Cl) ；HEPES平衡鹽溶液(自配)；電泳緩衝液 (0. 5XTBE,自配)；DNA上樣緩衝液；溴化乙啶(EB)。2、主要方法1 μ L AuNPs/氨基矽烷納米溶液(5mg AuNPs/氨基矽烷納米溶解在500 μ L雙蒸水 中)與 1 μ LpEGFP-C 1 水溶液(0. 1 μ g/ μ L)以及 8 μ 1 雙蒸水(pH = 7. 4water)在 1. 5mL 離心管中混合，置於室溫下30分鐘讓其充分結合。AuNPs/氨基矽烷納米和pEGFP-Cl的質 量比分別用100 1,50 1,30 1,10 1,1 1。在5000rpm的速度下離心5min。將 沉澱物加載到的瓊脂糖(ΕΒαι μ g/mL)在TAE的緩衝下，在100V電壓下跑40min，然後 在320nm處觀察條帶。3、結果請參閱圖1和圖2，結果觀察，有多種條帶出現，這是因為pEGFP-Cl有多種構型所 致。在質量比10 1,1 1處條帶清晰明顯，說明在這些質量比之下，DNA和納米顆粒結 合不是很好，到了 100 1,50 1,30 1條帶消失，說明結合完全了。這些結果表明帶正電荷的pEGFP-Cl和AuNPs/氨基矽烷納米有一個最佳的結合 比，超出30 1以後過多的納米顆粒顯得不再重要，所以使用30 1進行轉染。三、轉染1、主要材料人體臍靜脈內皮細胞(HUVEC) ；AuNPs/氨基矽烷納米@pEGFP_Cl聯合體(上述制 備)；DMEM培養基；胎牛血清FBS ；6孔培養板。2、主要方法(1)細胞的培養將HUVEC用胰蛋白酶-EDTA消化下來，計數後加入到6孔板中 (5 X IO6/孔)，用含FBSlO %的DMEM溶液並加轉染優化試劑培養至細胞密度為60 % 70 % 的融合度。(2)細胞轉染實驗將培養好的細胞上清除去，換新的培養液並加入質量比30 1 的AuNPs/氨基矽烷納米@pEGFP-Cl聯合體。請參閱圖3、圖4和圖5，培養48小時後分別 對其螢光、細胞存活率(碘化吡啶標識，流式細胞儀檢測)、轉染效率(流式細胞儀檢測)進 行測定。3、結果分析螢光圖可以看出有明顯綠色螢光，並且覆蓋面比較大。細胞生存率圖分別為無添 加物、AuNPs/氨基矽烷納米@pEGFP-Cl聯合體、lipofectamine 2000ipEGFP-Cl聯合體的生 存率，可以看到AuNPs/氨基矽烷納米@pEGFP-Cl聯合體對細胞生存率的影響是很小的。比 lipofectamine 20000 pEGFP-Cl聯合體的影響小很多。轉染效率圖可以看到AuNPs/氨基 矽烷納米@pEGFP-Cl聯合體可以達到約55%的轉染效率，這是在保證了細胞生存率的前提下達到了一個如此的轉染效率。雖然不及lipofectamine 2000高，但是其高細胞相容性是 lipofectamine2000所無法比擬的，表現出了 AuNPs/氨基矽烷納米做為轉染試劑的巨大潛 力。
權利要求
1. 一種納米基因導入材料，由HAuCl4三甲氧基矽基)丙基]-1，2-乙二胺為原料合成AuNPs/氨基矽烷納米球複合材料，其中HAuCl4與N-[3-(三甲氧基矽基)丙 基]-1，2-乙二胺的比率為1 4。
全文摘要
本發明公開了一種納米基因導入材料，由HAuCl4和N-[3-(三甲氧基矽基)丙基]-1，2-乙二胺為原料合成AuNPs/氨基矽烷納米球複合材料，其中HAuCl4與N-[3-(三甲氧基矽基)丙基]-1，2-乙二胺的比率為1∶4。本發明具有良好的細胞相容性、低毒、穩定且較高的轉染效率。
文檔編號C12N15/63GK102071209SQ201010574319
公開日2011年5月25日 申請日期2010年12月6日 優先權日2010年12月6日
發明者劉勇, 周鴻雁, 常光其, 張德元, 徐安武, 徐建波, 李梓倫, 王冕, 王深明, 王雷, 胡作軍 申請人:張德元, 徐安武, 王深明