唾液乳桿菌株sil1及其應用的製作方法

2023-04-23 03:36:26

專利名稱：唾液乳桿菌株sil1及其應用的製作方法
技術領域：
本發明主要涉及微生物技術領域，具體涉及一種新型益生菌唾液乳桿菌菌株SILl {Lactobacillus salivarius)及其應用。背景技術：
動物腸道中通常有一層微生物或微生物層，在正常情況下即動物處於健康狀況時，並 未表現異常或致病現象，這一層微生物稱為腸道微生物。它是動物胃腸道中不可缺少的組 成部分，對宿主動物絕大多數是有益無害的。使用無菌或抗生素處理的試驗動物所做的大 量試驗證明，由於腸道已經存在的微生物與侵入的病原菌競爭腸黏膜上的粘附位點，因此 腸道正常菌群可以競爭性排斥外來致病菌在腸道的定植。乳酸菌是動物體內的有益微生物之一，是動物腸道的正常定植菌群，其定植在腸 黏膜上皮細胞上，並抑制其它病原菌的粘附。在胃腸道400多種厭氧或好氧微生物中，乳酸 菌約佔10%。研究表現，與下痢豬相比，正常仔豬腸道大腸桿菌數量明顯下降，而乳酸桿菌 數大大提高；用乳酸桿菌接種仔豬，其腸組織勻漿液中大腸桿菌數量較對照組明顯降低，乳 酸桿菌數量大大提高。乳酸菌的抑菌機理主要是通過自身以及代謝產物與其它微生物之間 的相互作用，來調整菌群之間的關係，從而維持微生態環境中微生物群最佳優勢組合以及 這種組合的相對穩定。此外，乳酸菌易與腸黏膜上皮細胞結合，起佔位作用，對有害菌具有 屏障排除能力。基於乳酸菌的諸多優點，它已成為廣大從事乳酸菌食品添加劑、益生素開發、飼料 工業等領域研究人員的研究熱點。其中在飼料工業上，乳酸菌常和其他益生菌一起製成微 生態製劑用於飼料，來促進畜禽特別是幼齡動物的生長發育，減少發病率和死亡率。但是， 目前乳酸菌最大的缺點就是生命力十分脆弱，無法久存。研究發現，乳酸菌必須在腸道特定 部位才能產生功效。而天然乳酸菌不耐高溫、胃酸及膽鹽的侵蝕，經飼料制粒後大多數乳酸 菌會死亡，很難通過胃環境安全到達腸道發揮作用，也無法吸附在腸道黏膜的適當位置，結 果只能是隨著糞便排出體外，產生不了任何作用。鑑於此，強耐受力的乳酸菌株的分離和篩 選迫在眉睫，這不僅關係到綠色畜禽養殖業的可持續發展和動物性產品的安全生產，也是 保證廣大人民的健康生活、保護養殖生態環境和我國進入WTO參與國際競爭的必然選擇。
三
發明內容
技術問題
針對現有技術中存在的不足之處，本發明提供一種豬源唾液乳桿菌，對酸、膽鹽和溫度 具有良好的耐受性，能在模擬胃腸液中生長；60°C處理30min，不影響菌株的生長；對體外 共培養的大腸桿菌和沙門氏菌具有100%的抑菌效果，能在動物腸道定植，具有調節動物腸 道菌群分布和促進動物生長的功能。技術方案
為達到以上目的，是通過以下技術方案來實現的
提供一株唾液乳桿菌菌株，來源於斷奶仔豬，保藏名稱為唾液乳桿菌ilactobacillus■sah>ariM)SILl，保藏單位中國典型培養物保藏中心，地址武漢市武昌區珞珈山武漢 大學，保藏日期2010年10月沈日，保藏號CCTCC M2010281o該菌株革蘭氏陽性，顯微鏡下呈球形或卵圓形，成對或短鏈狀，無芽孢，無鞭毛；在 MC平板上生長，可形成粉色、表面光滑圓潤的小菌落，邊緣整齊，有溶鈣圈；在MRS液體培養 基中呈均勻渾濁生長，久置菌體呈白色沉澱。最適生長溫度35 38°C，適宜pH為5. 0 7.0，能在5%氯化鈉肉湯中生長。能夠利用蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽 糖、甘露醇、甘露糖、水楊苷、苦杏仁苷；不能夠利用阿拉伯糖、纖維二糖、松三糖、棉子糖、鼠 李糖、核糖、木糖、山梨醇。接觸酶、氧化酶陰性，不還原硝酸鹽，不液化明膠。本發明的唾液乳桿菌(Zacio^ciBttS salivarius) SILl株可以用於調節動物腸 道菌群，促進動物生長。有益效果
本發明的SILl經16S rRNA鑑定為唾液乳桿菌Oacio力aci/^As salimrius\抗逆性試驗表明，本發明的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)SlLl具有一 定的耐酸、耐膽鹽能力，能在PH3的培養液和膽鹽含量為6g/L的培養液中生長；能在模擬胃 腸液中生長；60°C處理30min，不影響其生長。體外抑菌試驗表明，SILl菌株對共同培養Mh的大腸桿菌0157和沙門氏菌的抑 菌率均達100%。小鼠應用試驗證明，本發明的唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)SIL1株可 以調節腸道菌群失調小鼠的腸道菌群分布，能在小鼠腸道定植，對小鼠的生長具有促進作用。四

圖1、唾液乳桿菌(Zacio^ci/^AS salivarius) SILl的生長曲線； 圖2、PCR擴增產物唾液乳桿菌Oacio力aci/^As salivarius)^lLl 16s rRNA基因片段 電泳圖
M: DNA Marker DL5000 ； 1 =SILl 菌株
圖3、雙酶切鑑定唾液乳桿菌(Zacio力aci/^As salivarius) SILl 16s rRNA基因片段 電泳圖
M: DNA Marker DL2000 ；1 =SILl 菌株 圖4、SILl對小鼠糞便菌群的影響
1 6日正常對照組；2 6日模型組；3 :11日正常對照組；4 11日自然恢復組 5:11日菌株治療組；6 16日正常對照組；7 16日自然恢復組；8 16日菌株治療組 圖5 SILl對小鼠糞便菌群的影響
1、2 21日正常對照組；3、4、5 21日自然恢復組；6、7、8 21日菌株治療組 五具體實施例方式
下面結合具體實施例，進一步闡述本發明。應理解，這些實施例僅用於說明本發明而不 用於限制本發明的範圍。實施例一菌株的分離
MC瓊脂培養基大豆蛋白腖5g，牛肉浸膏5g，酵母浸膏5g，葡萄糖20g，乳糖20g，碳酸 鈣10g，瓊脂15g，l%中性紅溶液5ml，蒸餾水1000ml, pH值6，121°C滅菌15min。
MRS液體培養基蛋白腖10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，檸檬酸氫二銨2g，葡萄糖 20g，吐溫-80 Iml，乙酸鈉5g，磷酸氫二鉀2g，硫酸鎂0. 58g，硫酸錳0. 25g，蒸餾水IOOOml， pH 值 6. 2 6. 4，121°C 滅菌 15min。27日齡健康斷奶仔豬，品種為蘇鍾豬，來源於江蘇省農科院六合動物試驗基地。心 髒放血，無菌採取迴腸內容物lg，於盛有5ml滅菌生理鹽水的試管中，混勻lOmin，取上清劃 線於MC平板，37°C恆溫培養M 4 後，挑取紅色有溶鈣圈的菌落，反覆接種篩選，直至得 到均勻的單個菌落，命名為SILl。革蘭氏染色鏡檢菌株SILl為G+，顯微鏡下呈球形或卵圓形，成對或短鏈狀，無芽 孢，無鞭毛；在MC平板上生長，可形成粉色、表面光滑圓潤的針尖狀小菌落，邊緣整齊，有溶 鈣圈；在MRS液體培養基中呈均勻渾濁生長，久置菌體呈白色沉澱。實施例二 菌株的理化及培養特性
1、菌株SILl能夠利用蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、甘露 糖、水楊苷、苦杏仁苷；不能夠利用阿拉伯糖、纖維二糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、核糖、木 糖、山梨醇。接觸酶、氧化酶陰性，不還原硝酸鹽，不液化明膠。菌株SILl最適生長溫度35 38°C，適宜pH為5. 0 7. 0，能在5%氯化鈉肉湯中生長。2、生長曲線的測定
將活化的SILl菌液以2 % (約106CfU/mL)的接種量接種於MRS液體培養基中，37°C， 160rpm,培養30h，每隔池取樣，在600nm下測定吸光值，繪製生長曲線圖。結果表明，SILl 培養池即進入對數生長期，14h進入穩定期。實施例三菌株的核酸鑑定 1、引物
根據GenBank中登錄的乳酸菌16S rRNA的基因序列，參考其368-1049位基因片段，設 計引物
F 5' -TCGGCTCGTAAAACTCTG-3，； R5， - GGACTTAACCCAACATCTCA -3，。引物由hvitrogen公司合成，擴增片段為V3-V7，長682bp。2、16s rRNA基因序列分析
挑取單菌落置離心管中，加入50 L無菌蒸餾水重懸，沸水浴2min，12000r/min, 5min, 上清中即含16S rRNA基因。PCR擴增體系為50 L體系，93°C預變性!Min ;94°C 45s, 55°C lmin, 72°C 1. 5min, 30個循環；72°C延伸lOmin。PCR產物回收後與pMD18_T載體連接，經 氨苄抗性與藍白斑篩選，I和III雙酶切鑑定，陽性質粒由hvitrogen公司進 行測序。3、結果
用1. 2%瓊脂糖凝膠電泳分析PCR產物，在682bp處出現特異性目的條帶，與預期大小 相符合(圖1)。用BamH I和Hind III對細菌克隆質粒進行雙酶切鑑定，片段與理論大小相 符合(圖2)。測序結果與GenBank中已發表的標準序列進行同源性比較後得出SILl菌株為 唾液乳桿菌(Zacio^ciBiAs salivarius),同源性為 99%。
實施例四菌株的抗逆性研究1、耐酸、耐膽鹽試驗
將活化的SILl菌液以2 % (約IO6 cfu/mL)的接種量分別接種於pH為3、4、5、6的MRS 液體培養基中，以及膽鹽濃度為0g/L、3g/L、6g/L的液體培養基中，每組設3個重複，37°C， 160r/min,培養他，取樣測各組菌液的OD6tltlnm值。2、溫度敏感試驗
將活化的SILl菌液以2 % (約IO6 cfu/mL)的接種量分別接種於5管MRS液體培養基 中，每管設3個重複，分別於45°C、50°C、55°C、60°C處理30 min後，37°C，160r/min，培養8 h，取樣測各組菌液的OD6tltlnm值。3、胃腸道耐受試驗
將MRS液體培養基加入NaCl 5 g/L，調pH值至3. 0，121°C滅菌15 min，無菌添加胃蛋 白酶5 g/L，製成模擬胃液。將MRS液體培養基加入豬膽鹽3 g/L, NaCl 5 g/L，調pH值至 8.0，121 °C滅菌15 min，無菌添加胰蛋白酶10 g/L，製成模擬腸液。將活化的SILl菌液以 2 % (約IO6 cfu/mL)的接種量分別接入到MRS液體培養基(對照)和模擬胃腸液中，每組設 3個重複，370C，200 r/min,培養12 h，取樣測各組菌液的OD6tltlnm值。5、結果
從結果來看，隨著培養液PH值的降低和膽鹽含量的升高，菌株的生長速度相應降低， 但在PH值為3的培養液和膽鹽含量為6g/L的培養液中仍能生長，說明該株菌具有一定的 耐酸、耐膽鹽能力；此外，菌株對胃蛋白酶和胰蛋白酶也有一定的抵抗力，能在模擬胃腸液 中生長；從表中可以看出，隨著菌株處理溫度(45°C飛0°C )的升高，其OD6tltlnm值呈下降趨勢， 但60°C處理30min，不影響菌株的生長。表1各組菌液的OD6tltlnm平均值
權利要求
1.一株唾液乳桿菌菌株SIL1，為唾液乳桿菌(Lac tobacillus sali varius )，保藏單 位中國典型培養物保藏中心，地址武漢市武昌區珞珈山武漢大學，保藏日期2010年10 月 26 日，保藏號=CCTCC M2010281 ；該菌株革蘭氏陽性，顯微鏡下呈球形或卵圓形，成對或短鏈狀，無芽孢，無鞭毛；在MC 平板上生長，可形成粉色、表面光滑圓潤的小菌落，邊緣整齊，有溶鈣圈；在MRS液體培養基 中呈均勻渾濁生長，久置菌體呈白色沉澱；最適生長溫度35 38°C，適宜pH為5. 0 7. 0， 能在5%氯化鈉肉湯中生長；能夠利用蔗糖、海藻糖、果糖、乳糖、半乳糖、葡萄糖、麥芽糖、甘 露醇、甘露糖、水楊苷、苦杏仁苷；不能夠利用阿拉伯糖、纖維二糖、松三糖、棉子糖、鼠李糖、 核糖、木糖、山梨醇；接觸酶、氧化酶陰性，不還原硝酸鹽，不液化明膠。
2.權利要求1所述菌株SILl的調節動物腸道菌群、促進動物生長中的應用。
全文摘要
本發明公開了一株豬源唾液乳桿菌SIL1及其應用，屬於微生物技術領域。該唾液乳桿菌(Lactobacillus salivarius)SIL1對酸、膽鹽和溫度具有良好的耐受性，耐受pH3和膽鹽含量為6g/L的培養液，能在模擬胃腸液中生長，60℃處理30min，不影響菌株的生長。本發明的唾液乳桿菌對體外共培養的大腸桿菌和沙門氏菌具有100%的抑菌效果，能在動物腸道定植，具有調節動物腸道菌群分布和促進動物生長的功能。
文檔編號C12R1/225GK102061272SQ20101052343
公開日2011年5月18日 申請日期2010年10月28日 優先權日2010年10月28日
發明者劉小娟, 周宇, 朱小翠, 王冉, 王曉麗, 王永山, 諸玉梅 申請人:江蘇省農業科學院