柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39基因及其應用的製作方法

2023-04-23 00:12:41

柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白Et CHP39基因及其應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種柔嫩艾美耳球蟲基因，該基因為Et CHP39基因，包含SEQ ID NO.1所示的開放閱讀框核苷酸序列。本發明的柔嫩艾美耳球蟲基因，是柔嫩艾美耳球蟲的新基因，與子孢子入侵宿主細胞相關，對開發抑制子孢子入侵宿主細胞、阻斷球蟲生活史的新疫苗或新藥具有很高的應用價值。
【專利說明】柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39基因及其應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及生物工程【技術領域】，尤其涉及一種柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39 基因及其應用。

【背景技術】
[0002] 雞球蟲病是幾種艾美耳球蟲寄生腸道所引起的一種危害極其嚴重的全球性寄生 蟲病，嚴重危害雞的生長發育，是集約化養雞業危害最大的疾病之一，每年給養雞業造成巨 大的經濟損失。柔嫩艾美耳球蟲（Eimeriatenella)是致病性最為嚴重的雞球蟲之一，它 主要寄生於盲腸及其附近區域，能夠引起出血性腸炎，對雛雞危害最大，嚴重時能引起較高 的死亡率。目前控制雞球蟲病的方法主要以在飼料中添加抗球蟲藥物預防為主，但由於抗 球蟲藥的長期使用，雞球蟲耐藥性的產生已成為無法避免的問題，任何一種抗球蟲藥在使 用一定時間後都會引起球蟲的耐藥性，使得許多抗球蟲藥的防治效果顯著降低，甚至完全 失效，即使提高藥物濃度也無濟於事，仍然爆發球蟲病，給養雞業帶來了無法彌補的損失。 同時因球蟲產生耐藥性，使好不容易篩選出來的抗球蟲藥使用年限大大縮減，新藥開發速 度已趕不上耐藥株出現的速度。而且抗球蟲藥作為飼料添加劑的潛在危害又逐漸成為人們 關注的對象，食品安全日益受到關注，很多曾經效果很好的抗球蟲藥都被劃入禁用之列，因 此，人們期待用更理想的方法來替代抗球蟲藥物的使用。球蟲活卵囊疫苗的成功研製和應 用提供了一種可以替代藥物控制雞球蟲病的技術手段。但活疫苗不可避免地存在難保存、 散毒及潛在的致病威脅等缺點，未能在雞場得到廣泛使用，所以迫切需要尋找新的防治手 段來控制雞球蟲病。而研製新疫苗和新藥物的關鍵在於尋找到合適的蟲體抗原基因或基因 產物作為防治球蟲病的作用靶標。
[0003] 雞球蟲是屬於頂復器門（Apicomplexa)艾美耳屬（Eimeria)的一類寄生於雞腸 道的原蟲。頂復器原蟲多數是專一性的細胞內寄生蟲，包括瘧原蟲（Plasmodium)、弓形蟲 (Toxoplasma)、艾美耳球蟲（Eimeria)、隱孢子蟲（Cryptosporidium)等，有複雜的生活史， 需入侵宿主細胞，完成生活史循環需要更替一個或多個宿主，或更換不同的細胞和組織，因 而成功地入侵宿主細胞是這類寄生蟲感染建立的前提。雖然頂復器原蟲入侵的宿主細胞不 同，包括紅細胞、淋巴細胞、巨噬細胞和消化道細胞等，但都有一個共同的高度保守的入侵 機制，需要頂復器（微線、棒狀體和緻密顆粒）分泌一系列蛋白參與，這些蛋白相互作用，在 宿主細胞膜與蟲體表面形成一個高度保守的運動結構（MovingJunction,MJ),對蟲體入侵 宿主細胞起至關重要的作用。


【發明內容】

[0004] 本發明要解決針對藥物防治球蟲病極易產生耐藥性的問題急需開發新型疫苗和 新藥的技術問題，提供一種柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39基因，該EtCHP39在柔嫩艾 美耳球蟲入侵宿主細胞過程中起著重要作用，對開發防治雞球蟲病的新疫苗或新藥具有很 高的應用價值。
[0005] 此外，還需要提供一種柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39基因的應用。
[0006] 為了解決上述技術問題，本發明通過如下技術方案實現：
[0007] 在本發明的一個方面，提供了一種柔嫩艾美耳球蟲基因，該基因為EtCHP39基因， 包含SEQIDNO. 1所示的開放閱讀框核苷酸序列。
[0008] 優選的，所述基因具有SEQIDN0. 2所示的核苷酸序列。
[0009] 在本發明的另一方面，提供了一種重組載體，包含編碼EtCHP39蛋白胺基酸序列 的核苷酸序列，所述EtCHP39蛋白胺基酸序列如SEQIDN0. 3所示。
[0010] 所述重組載體包括重組克隆載體或重組表達載體，重組表達載體包括重組原核表 達載體、重組真核表達載體。
[0011] 在本發明的另一方面，還提供了一種重組蛋白，該重組蛋白是由上述重組載體經 表達而製得。
[0012] 在本發明的另一方面，還提供了一種多克隆抗體，該多克隆抗體是用上述重組蛋 白免疫兔子而製得。
[0013] 在本發明的另一方面，還提供了一種上述柔嫩艾美耳球蟲基因的應用，用於製備 預防或治療雞球蟲病的疫苗或藥物。
[0014] 所述疫苗或藥物通過抑制柔嫩艾美耳球蟲子孢子入侵宿主細胞而阻斷球蟲生活 史來發揮作用。
[0015] 在本發明的另一方面，還提供了一種上述柔嫩艾美耳球蟲基因的應用，用於篩選 預防或治療球蟲病的藥物。
[0016] 在本發明的另一方面，還提供了一種疫苗，包含上述重組蛋白，或上述重組載體， 該重組載體為真核表達載體。
[0017] 在本發明的另一方面，還提供了一種作用靶標為EtCHP39蛋白的抗球蟲藥物。
[0018] 本發明柔嫩艾美耳球蟲保守蛋白EtCHP39基因，是柔嫩艾美耳球蟲（Eimeria tenella)的一個新基因。Western-blot分析表明本發明EtCHP39的原核表達產物和真 核表達產物都具有良好的免疫原性；免疫螢光定位實驗和體外抑制試驗結果顯示EtCHP39 與子孢子的入侵相關，在球蟲子孢子入侵宿主細胞時發揮了重要作用。因此，本發明的Et CHP39基因，為開發抑制子孢子入侵、阻斷球蟲生活史的新疫苗或新藥提供了新思路。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0019] 下面結合附圖和【具體實施方式】對本發明作進一步詳細的說明。
[0020] 圖1是本發明實施例1柔嫩艾美耳球蟲EtCHP39基因擴增產物電泳鑑定圖；
[0021] 圖2是本發明實施例2實時定量PCR檢測EtCHP39基因在柔嫩艾美耳球蟲不同 發育階段的表達圖；
[0022] 圖3是本發明實施例3重組原核表達質粒pET-EtCHP39的雙酶切鑑定圖；
[0023] 圖4是本發明實施例3重組表達質粒pET-EtCHP39不同時相表達蛋白的 SDS-PAGE電泳圖；
[0024] 圖5是本發明實施例3純化的EtCHP39重組蛋白分析圖；
[0025] 圖6是本發明實施例5的EtCHP39蛋白免疫原性分析圖；
[0026] 圖7是本發明實施例6免疫螢光檢測EtCHP39蛋白在柔嫩艾美耳球蟲不同發育 階段的分布和定位圖；
[0027] 圖8是本發明實施例7體外抑制試驗結果圖；
[0028] 圖9是本發明實施例8重組真核表達質粒pcDNA3. 1-flag-Et CHP39的PCR鑑定 和雙酶切鑑定圖；
[0029] 圖10是本發明實施例8重組真核表達質粒pcDNA3. 1-flag-Et CHP 39轉染BHK 細胞的表達結果圖；
[0030] 圖11是本發明實施例8重組真核表達質粒pcDNA3. 1-flag-Et CHP 39轉染BHK 細胞表達後Western-Blot檢測結果圖。

【具體實施方式】
[0031] 下列實施例中，未註明具體條件的實驗方法，通常按常規條件，如《分子克隆實驗 指南》（J.薩姆布魯克，D.W.拉塞爾著，黃培堂，汪嘉璽，朱厚礎，等譯.第3版，北京：科學 出版社，2002)中所述的方法進行。
[0032] 本發明以柔嫩艾美耳球蟲為研究對象，篩選鑑定參與柔嫩艾美耳球蟲入侵宿主細 胞的相關蛋白。在前期實驗室以柔嫩艾美耳球蟲頂體膜蛋白l(EtAMAl)為誘餌，篩選柔嫩 艾美耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫獲得可能與之相互作用蛋白的EST序列基礎上， 選擇編號為39基因的EST序列，利用RACE(末端快速擴增）技術擴增獲得了含一個完整 0RF(開放閱讀框）的基因全長序列，在原核表達系統和真核表達系統中成功表達該基因蛋 白，並通過實驗表明對EtCHP39與子孢子的入侵相關。
[0033] 實施例1柔嫩艾美耳球蟲EtCHP39基因全長cDNA的克隆及分析
[0034] 1?材料
[0035] 蟲株和體外培養細胞：柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella)是由中國農業科學院上海獸 醫研究所保存、繁殖提供。DF-1 (雞胚成纖維細胞）細胞用於感染、抑制、免疫螢光試驗和轉 染真核表達重組質粒。
[0036]2?方法
[0037] 2. 1 總RNA提取
[0038] 實驗前將乾淨的金屬提取器皿單獨使用錫箔紙包好，180°C烤箱內烘烤6h。操作臺 和離心管架等均用75%酒精消毒，保證無RNase汙染。所用移液槍、槍頭和離心管均專一用 於RNA的提取。
[0039] 子孢子總RNA的提取參照Trizol試劑說明書操作，具體詳細步驟為：
[0040] 1)取保存於液氮中的E.tenella子孢子，加入適量Trizol試劑並充分混勻，室溫 靜置6min。
[0041] 2)向步驟1)中加入氯仿（按lmLTrizol加200iiL氯仿），蓋緊離心管蓋，用手 顛倒混勻數次，再室溫靜置15min。
[0042] 3) 4°C12000r/min離心 15min。
[0043] 4)從離心機中小心取出離心管，此時勻漿液分為三層，即：無色的上清液、中間的 白色蛋白層及帶有顏色的下層有機相。吸取上清液轉移至另一新的離心管中（切忌吸出白 色中間層）。
[0044] 5)向上清中加入等體積的異丙醇，顛倒離心管充分混勻後，在15?30°C下靜置 10mim〇
[0045] 6)4°C，12000r/min離心lOmin，RNA沉於管底。
[0046] 7)小心棄上清，緩慢地沿離心管壁加入75%的乙醇111^(0￡?(：水配製），溫和振蕩 沉澱。
[0047] 8)4°C，12000r/min離心5min後小心棄去乙醇，沉澱室溫乾燥至無乙醇氣味，用少 量DEPC水溶解沉澱。電泳分析，並測定其濃度和分析其純度。
[0048] 2. 2RACE擴增cDNA模板的製備：按照GeneRacer?Kit(美國Invitrogen公司）說 明書操作步驟將提取的柔嫩艾美耳球蟲子孢子總RNA反轉錄合成cDNA第一鏈。
[0049] 2. 3柔嫩艾美耳球蟲EtCHP39基因的5'RACE擴增
[0050] 5 '端RACE引物設計合成：
[0051] 在前期實驗室利用柔嫩艾美耳球蟲頂體膜蛋白l(EtAMAl)為誘餌，篩選柔嫩艾美 耳球蟲子孢子酵母雙雜交cDNA文庫，獲得可能相互作用蛋白的ESTs序列基礎上，本發明選 擇其中一個基因的EST序列，該EST序列含3'末端的Ploy(A)尾。Blast分析與柔嫩艾美 耳球蟲保守的假象蛋白（hypotheticalprotein,conserved)同源，該EST序列編號為39。 利用PrimerPremier5. 00軟體設計5'端的引物，5'端RACE擴增引物見下表1。
[0052] 表1 5'端RACE擴增引物序列

【權利要求】
1. 一種柔嫩艾美耳球蟲基因，其特徵在於，所述基因為Et CHP39基因，包含SEQ ID NO. 1所示的開放閱讀框核苷酸序列。
2. 根據權利要求1所述的柔嫩艾美耳球蟲基因，其特徵在於，所述基因具有SEQ ID NO. 2所示的核苷酸序列。
3. -種重組載體，其特徵在於，包含編碼Et CHP39蛋白胺基酸序列的核苷酸序列，所 述Et CHP39蛋白胺基酸序列如SEQ ID NO. 3所示。
4. 一種重組蛋白，其特徵在於，該重組蛋白是由權利要求3所述重組載體經表達而制 得。
5. -種多克隆抗體，其特徵在於，該多克隆抗體是用權利要求4所述重組蛋白免疫兔 子而製得。
6. 權利要求1所述柔嫩艾美耳球蟲基因的應用，其特徵在於，用於製備預防或治療雞 球蟲病的疫苗或藥物。
7. 權利要求1所述柔嫩艾美耳球蟲基因的應用，其特徵在於，用於篩選預防或治療雞 球蟲病的藥物。
8. 權利要求4所述重組蛋白的應用，其特徵在於，用於製備預防或治療雞球蟲病的疫 苗或藥物。
9. 一種疫苗，其特徵在於，包含權利要求4所述重組蛋白，或權利要求3所述重組載體， 該重組載體為真核表達載體。
10. -種作用靶標為Et CHP39蛋白的抗球蟲藥物。
【文檔編號】A61K39/012GK104328129SQ201410382551
【公開日】2015年2月4日 申請日期:2014年8月6日 優先權日:2014年8月6日
【發明者】韓紅玉, 黃兵, 翟頎, 董輝, 趙其平, 朱順海, 梁思婷, 李莎, 楊斯涵 申請人:中國農業科學院上海獸醫研究所