一種基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白篩選和鑑定方法
2023-04-24 10:41:21
專利名稱：一種基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白篩選和鑑定方法
技術領域：
本發明屬於中醫藥技術領域。具體涉及一種基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白的篩選和鑑定方法及其應用。
背景技術：
針灸是我國常用的臨床治療疾病的方法之一，其臨床有效性正在被世界多國接受或成為醫療方法之一被推廣應用。
在中國，經臨床實踐證明，針灸治療有效的病種包括神經、內分泌、免疫、循環、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感覺、運動等機體各個系統的疾病約300餘種，並隨著臨床應用的擴展，針灸治療的有效病症在不斷增加。
研究工作在證明針灸作用的臨床有效性前提下，對針灸治療疾病的作用原理也進行了深入研究。結果表明，針灸作用具有整體、雙向調節的特點，其調節作用可通過神經—內分泌—免疫網絡等多途徑得到發揮，從而證明針灸效應的存在。
以針灸臨床有效性為基礎的針灸作用原理研究，引出了針灸效應物質基礎的深層次問題。由於針灸效應的整體性和雙向性特點，難以用單一的檢測方法對其效應物質基礎進行逐一研究，因此引入高通量的系統、同步研究方法，成為針灸效應物質基礎研究的突破口。高通量的基因組學和蛋白質組學理論與技術為這一研究創造了良好的工作平臺。
發明內容
本發明所要解決的技術問題在於研究針灸效應的響應基因和應答蛋白，設計該蛋白的篩選和鑑定方法。
本發明提供了一種基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白的篩選和鑑定方法。
本發明的方法是基於這樣的原理針灸效應是一種生命活動現象，生命活動是建立在蛋白質及其相互作用基礎上的信息傳導過程，這一過程是基因表達、蛋白質功能表現、蛋白質—蛋白質相互作用的信息反應序列。因此從基因、蛋白質入手，研究針灸效應的響應基因和應答蛋白，將是針灸效應物質基礎研究的最佳突破口。高通量的基因組學和蛋白質組學理論與技術也為這一研究創造了良好的工作平臺。
本發明的方法包括下列步驟(1)採集樣本採取疾病機體或模型疾病機體經針灸治療後的血液、組織液、非人體組織的組織器官與組織器官勻漿液。將血液、組織液、組織器官勻漿液存放於-80℃冰箱中，非人體的組織器官存放於液氮中；(2)基因表達序列分析對針灸治療後的非人體組織器官進行針灸效應差異表達基因分析，並以差異表達基因標籤為線索，獲得針刺響應基因相對應的表達蛋白(特定效應蛋白)；(3)針灸治療特定蛋白篩選採用蛋白質組技術對針灸治療後的血液、組織液、非人體組織的組織器官勻漿液進行針灸治療特定蛋白篩選；(4)針灸特定效應蛋白的鑑定採用質譜分析方法。回收針灸響應基因所對應的表達蛋白，切取分離蛋白質組的差異蛋白點，用胰蛋白酶酶解後進行質譜分析，獲得的肽譜圖進行聯機資料庫和網絡資料庫分析，獲得差異表達蛋白質的胺基酸序列。確定針刺效應特定蛋白的胺基酸序列；(5)針灸特定效應蛋白的活性分析將針灸特定效應蛋白應用於相應的疾病動物模型，以適合疾病的方法檢測其對疾病的治療作用；或選擇相應疾病的已知靶點，應用配體垂釣技術檢測針灸特定效應蛋白對疾病已知靶點的抑制或激動作用。
本發明的方法中所指的針灸方法可以是傳統的針灸方法以及傳統針灸方法與電學、光學、聲學、磁學相結合的現代針灸方法，如針刺、艾灸、拔火罐、溫針、電針、頭針、穴位注射、穴位敷貼、穴位埋藏、穴位割治、穴位挑治、穴位結紮、刺絡放血、雷射針、冷凍針、皮膚針或耳針。針灸治療有效的病種可以是神經、內分泌、免疫、循環、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感覺或運動機體各個系統的疾病。針灸作用的對象可以是人體、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、貓、豬、馬、牛或羊。
本發明的另一目的是提供了基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白在藥物篩選中的應用，該應用的方法包括下列步驟1)將針灸特定效應蛋白應用於相應的疾病動物模型，以適合疾病的方法檢測其對疾病的治療作用；2)選擇相應疾病的已知靶點，應用配體垂釣技術檢測針灸特定效應蛋白對疾病已知靶點的抑制或激動作用。
本發明針灸效應特定蛋白在藥物篩選中的應用，可以採用以下方法實現1)將針灸特定效應蛋白應用於相應的疾病動物模型，以適合疾病的方法檢測其對疾病的治療作用，根據其對動物疾病模型治療的有效性，搜尋其在人體的同源蛋白，或對其進行結構改造取消其在人體的異質性，應用基因工程的方法生產生物製劑藥品；2)選擇相應疾病的已知靶點，應用配體垂釣技術檢測針灸特定效應蛋白對疾病已知靶點的抑制或激動作用，根據其作用，再將針灸特定效應蛋白做為配體，利用配體垂釣技術篩選與之相結合的小分子化合物，將與之相結合的小分子化合物直接或經過結構改造進行藥物篩選；3)根據針灸特定效應蛋白的三維結構，利用計算機虛擬篩選技術，快速篩選與之相作用的小分子化合物，將與之相作用的小分子化合物直接或經過結構改造進行藥物篩選。
創新藥物是現代生物醫藥發展的核心，靶標發現是創新藥物的首要步驟。傳統的靶標發現依賴於病理生理機制的發展，存在靶標功能驗證過程中失敗率較高的投入風險。
本發明以建立在針灸治療有效性基礎上的針灸效應響應基因和應答蛋白為靶標篩選起點，其篩選範圍建立在有效性基礎之上，可最大限度避免上述風險，提高靶標篩選成功率，同時創立以針灸治療為基礎的靶標篩選策略，在藥物篩選中將有很大的應用價值。
具體實施例方式實施例1 哮喘模型大鼠針刺治療後血清中抗哮喘活性蛋白的篩選與鑑定選擇臨床上針灸治療哮喘有效的方法，用於治療模型哮喘大鼠，隔天針刺大鼠大椎、肺俞、風門穴1次，14天後，心臟採血法採取針刺治療後的哮喘大鼠血液，常規方法製備血清(稱之為「針刺血清」)。將針刺血清首先經液相色譜分析，分為＜14.3kD、14.3kD-45kD、＞45kD三個分子量段，將不同分子量段的針刺血清分別使用蛋白質組的2-DE蛋白質電泳分離技術，獲得了五個與針刺抗哮喘有關的特異表達蛋白點，它們是點1MW＝39.8kD，PI＝4.9；點2MW＝39.5kD，PI＝5.0；點3MW＝44.1kD，PI＝5.1；點4MW＝17.3kD，PI＜4.5；點5MW＝16.9kD，PI＜4.5。切取上述5個特異蛋白質點，進行質譜分析，這五個蛋白質點分別是鋅指蛋白208、甲狀腺激素受體相關蛋白、60S核糖體蛋白L13或假想蛋白FLJ32191、免疫抑制劑的受體A04604、鋅指蛋白91。其中蛋白質點4被質譜鑑定為一種免疫抑制劑的受體，我們稱之為A04604。將A04604注射入哮喘大鼠，可以明顯降低哮喘大鼠的氣道阻力，具有明顯的抗哮喘藥物開發前景。
根據A04604的胺基酸序列，從資料庫中檢索到了其三維結構，將A04604的三維結構，利用計算機虛擬篩選技術和小分子化合物資料庫，篩選出了8種與之相作用的小分子化合物，這些小分子化合物是藥物篩選的基礎。
將A04604作為配體，應用配體垂釣技術檢測到該蛋白與四種植物來源的小分子化合物有明顯的結合活性。這四種植物來源的小分子化合物為藥物篩選提供了物質基礎。
實施例2 便秘模型大鼠針刺治療後大腸組織勻漿液中抗便秘蛋白的篩選與鑑定用複方地芬諾酯(10.0mg/kg)灌胃方法製備大鼠便秘模型，根據臨床經驗選取「合谷」、「後三裡」兩穴對便秘大鼠進行針刺治療。治療結束後處死大鼠，迅速分離大鼠大腸，用NS衝洗乾淨後，用濾紙吸淨多餘水分，剪取約200mg大腸組織，加入2.0ml細胞裂解液，在冰水混合物中以1500轉/min製備勻漿，反覆凍融3個循環，加入20μg/ml脫氧核糖核酸酶I 10μl和5μg/ml核糖核酸酶A 10μl，4℃作用15分鐘後，以每分鐘12000轉離心30分鐘，收集上清液製得大腸蛋白質提取液。用蛋白質組的SDS-PAGE蛋白質分離技術，對針刺治療後的大鼠大腸蛋白質提取液進行電泳分析，篩選得到分子量為27.24kDa和22.79kDa兩個蛋白條帶與針刺治療大鼠便秘模型有關。切取這兩個特異的蛋白質條帶，進行質譜分析，它們分別是蛋白質C5081和C5082，製備這兩種蛋白質的抗體，並將其按一定比例混合應用於便秘大鼠，可明顯環節大鼠便秘症狀，證明其具有良好的抗大鼠便秘作用。為進一步藥物篩選奠定了工作基礎。
實施例3 哮喘模型大鼠針刺治療後肺組織中針刺相應基因表達蛋白的篩選與鑑定選擇臨床上針灸治療哮喘有效的方法，用於治療模型哮喘大鼠，隔天針刺大鼠大椎、肺俞、風門穴1次，14天後，採取針刺治療後哮喘大鼠的肺組織，快速在冰冷條件下用生理鹽水清洗乾淨肺組織表面的血液，剔除脂肪和無關結締組織，迅速將清洗乾淨的肺組織置液氮中保存。
根據基因表達序列分析方法的操作手冊進行針刺抗哮喘效應相應基因的基因表達序列分析。經過抽提樣品總RNA、分離mRNA、連接帶oligo(dT)的磁珠、合成cDNA第一鏈、合成cDNA第二鏈、Nla III酶切、cDNA連接接頭、標籤酶酶切、將標籤體連接成雙標籤體、擴增102bp的雙標籤體並分離純化、分離純化26bp的雙標籤體、連接26bp的雙標籤體、克隆連接體至載體pZErO-1中並轉化、PCR鑑定及測序、數據分析等步驟，得到最終SAGE標籤體序列的資料庫及相關的統計報告。經數據對比分析，明確針刺抗哮喘效應響應基因差異表達序列所代表的基因注釋。將SAGE結果提示差異的基因，通過RT-PCR、Northern Blot驗證差異的準確性。以針刺抗哮喘差異表達響應基因標籤為線索，擴增相應全長cDNA序列，並將全長cDNA構入表達載體，回收針刺響應基因相對應的表達蛋白。
將回收的針刺響應基因相對應的表達蛋白經過質譜鑑定，獲得了一種與抗哮喘有關的蛋白質G208。將G208注射入哮喘大鼠，可以明顯降低哮喘大鼠的氣道阻力，具有明顯的抗哮喘藥物開發前景。
權利要求
1.一種於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白的篩選和鑑定方法，其特徵在於該方法包括下列步驟①採集樣本採取疾病機體或模型疾病機體經針灸治療後的血液、組織液、非人體組織的組織器官與組織器官勻漿液，將血液、組織液、組織器官勻漿液存放於-80℃冰箱中，非人體的組織器官存放於液氮中；②基因表達序列分析對針灸治療後的非人體組織器官進行針灸效應差異表達基因分析，並以差異表達基因標籤為線索，獲得針刺響應基因相對應的表達蛋白(特定效應蛋白)；③針灸治療特定蛋白篩選採用蛋白質組技術對針灸治療後的血液、組織液、非人體組織的組織器官勻漿液進行針灸治療特定蛋白篩選；④針灸特定效應蛋白的鑑定採用質譜分析方法，回收針灸響應基因所對應的表達蛋白，切取分離蛋白質組的差異蛋白點，用胰蛋白酶酶解後進行質譜分析，獲得的肽譜圖進行聯機資料庫和網絡資料庫分析，獲得差異表達蛋白質的胺基酸序列，確定針刺效應特定蛋白的胺基酸序列；⑤針灸特定效應蛋白的活性分析將針灸特定效應蛋白應用於相應的疾病動物模型，以適合疾病的方法檢測其對疾病的治療作用；或選擇相應疾病的已知靶點，應用配體垂釣技術檢測針灸特定效應蛋白對疾病已知靶點的抑制或激動作用。
2.根據權利要求1所述的一種於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白的篩選和鑑定方法，其特徵在於其中所述的針灸包括可以是傳統的針灸方法以及傳統針灸方法與電學、光學、聲學、磁學相結合的現代針灸方法，如針刺、艾灸、拔火罐、溫針、電針、頭針、穴位注射、穴位敷貼、穴位埋藏、穴位割治、穴位挑治、穴位結紮、刺絡放血、雷射針、冷凍針、皮膚針或耳針；針灸治療有效的病種可以是神經、內分泌、免疫、循環、消化、呼吸、泌尿、生殖、血液、感覺或運動機體各個系統的疾病；針灸作用的對象可以是人體、大鼠、小鼠、豚鼠、兔、狗、貓、豬、馬、牛或羊。
3.基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白在藥物篩選中的應用，其特徵在於該應用方法包括下列步驟1)將針灸特定效應蛋白應用於相應的疾病動物模型，以適合疾病的方法檢測其對疾病的治療作用，根據其對動物疾病模型治療的有效性，搜尋其在人體的同源蛋白，或對其進行結構改造取消其在人體的異質性，應用基因工程的方法生產生物製劑藥品；2)選擇相應疾病的已知靶點，應用配體垂釣技術檢測針灸特定效應蛋白對疾病已知靶點的抑制或激動作用，根據其作用，再將針灸特定效應蛋白做為配體，利用配體垂釣技術篩選與之相結合的小分子化合物，將與之相結合的小分子化合物直接或經過結構改造進行藥物篩選；3)根據針灸特定效應蛋白的三維結構，利用計算機虛擬篩選技術，快速篩選與之相作用的小分子化合物，將與之相作用的小分子化合物直接或經過結構改造進行藥物篩選。
全文摘要
本發明提供了一種基於針灸作用有效性的機體特定效應蛋白的篩選和鑑定方法。本發明研究針灸效應的響應基因和應答蛋白，以針灸作用的有效性為基礎，建立在基因組和蛋白質組技術平臺上的針灸效應特定蛋白的篩選和鑑定方法。本發明的方法在藥物篩選中有很大的實用價值。
文檔編號A61H39/08GK1623499SQ20041006766
公開日2005年6月8日 申請日期2004年10月29日 優先權日2004年10月29日
發明者楊永清, 王宇, 陳漢平, 崔建美 申請人:上海市針灸經絡研究所, 上海中醫藥大學