一種鹿骨膜條件培養液的製備方法及應用的製作方法

2023-04-24 22:17:16 2

一種鹿骨膜條件培養液的製備方法及應用的製作方法
【專利摘要】本發明公開了一種鹿骨膜條件培養液的製備方法及應用，屬於細胞組織培養【技術領域】。本發明所提供的方法是將鹿骨膜組織切片後置於插入皿中，向插入皿中加入培養基培養，培養後收集培養液，過濾後獲得條件培養液；所述插入皿由上室和下室組成，培養時插入皿放入多孔培養板中。本發明所提供的方法能夠使鹿骨膜組織在離體培養條件下分泌活性物質，進而收集、分析所分泌的活性物質，解決了離體培養不能為組織提供立體的培養環境、培養過程中二氧化碳濃度很難控制以及不能隨時收集條件培養液的難題，同時本發明的方法還有效提高培養組織的成活率，並縮短了組織的培養時間，且能夠隨時收集條件培養液。
【專利說明】一種鹿骨膜條件培養液的製備方法及應用

【技術領域】
[0001] 本發明涉及一種鹿骨膜條件培養液的製備方法及應用，屬於細胞組織培養技術領 域。

【背景技術】
[0002] 鹿茸是目前所知的唯一能夠完全再生的複雜哺乳動物器官，其再生包括軟骨、骨、 皮膚、血管和神經的再生。其中對神經再生的研究發現：鹿茸神經的再生和快速生長主要由 角柄骨膜來源的生物分子的刺激實現的。而要想分析這些角柄骨膜來源的生物分子，必須 建立一個離體的培養體系。
[0003] 在細胞培養過程中，細胞可能會分泌活性物質到培養液中，這種培養過某種細胞 或組織以後，含有細胞或組織分泌物的培養液就叫做條件培養液。目前對細胞條件培養液 的研究較多。由於組織培養的複雜性，對組織條件培養液的製備體系很少，尤其是骨膜組織 條件培養液的製備技術尚未見報導。
[0004] 但細胞條件培養液只能反映離體條件下，單個細胞分泌活性物質的情況，而活體 條件下，細胞的任何活動都離不開細胞間質，所以單純的細胞條件培養液並不能反映組織 中細胞與其間質相互作用的情況下，分泌活性物質的情況。現有技術中組織條件培養液的 製備方法多是利用三角瓶，再向三角瓶中充滿二氧化碳氣體進行密封培養。這種培養不能 為組織提供立體的培養環境，而且培養過程中二氧化碳濃度很難控制，培養過程中不能隨 時收集條件培養液。


【發明內容】

[0005] 為解決上述問題，本發明提供了一種鹿骨膜條件培養液的製備方法，所採取的技 術方案如下：
[0006] 本發明的目的在於提供一種鹿骨膜條件培養液的製備方法，該方法是將鹿骨膜組 織切片後置於插入皿中，向插入皿中加入培養基培養，培養後收集培養液，過濾後獲得條件 培養液；
[0007] 所述插入皿底部由孔徑為0. 4μπι的滌綸樹脂材料製成，培養時插入皿放入多孔 培養板中，這樣就將培養空間分成了上室和下室，且上室和下室之間有培養液的溝通
[0008] 所述製備方法的步驟如下：
[0009] 1)利用動物組織切割器將活體採集的鹿骨膜組織切割成薄片，獲得骨膜組織切 片；
[0010] 2)將步驟1)所得的骨膜組織切片放入包被好的插入皿中，再將插入皿放到多孔 培養板的孔中；
[0011] 3)向插入皿和培養板中加入液體培養基培養，培養完成後收集培養液；
[0012] 4)用濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得條件培養液。
[0013] 步驟1)所述骨膜組織切片，長2-6mm，寬1. 5-2mm，厚0. 2-1. 7mm。
[0014] 步驟2)所述骨膜組織放入包被好的插入皿，是將10-100片骨膜組織切片放入到 用鼠尾膠原或I型膠原包被的插入皿中；所述插入皿將培養空間分為上室和下室，上室和 下室通過0. 4 μ m孔徑的滌綸樹脂膜聯通；所述多孔培養板，培養孔的數量可以為24,12,或 6個。
[0015] 步驟3)所述液體培養液為神經培養液，具體組成為：neurobasal medium(Gibco) 加入 2% B27supplement(Life Technologies)再加入 1%抗生素（Gibco)。
[0016] 步驟3)所述培養，培養溫度為37°C，C02濃度為5%，溼度為飽和溼度，培養時間為 2 _4d。
[0017] 步驟4)所述濾膜過濾，是利用0.22 μ m的濾膜進行過濾。
[0018] 所述方法的具體步驟如下：
[0019] 1)利用動物組織切割器將活體採集的鹿骨膜組織切割成長2-6mm，寬1. 5-2mm，厚 0. 2-1. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0020] 2)將10-100片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用鼠尾膠原包被的插入皿中，再 將插入皿放到多孔培養板的孔中；
[0021] 3)向插入皿和培養板中加入神經培養液，於37°C，C02濃度為5%，溼度為飽和溼 度的條件下培養2-4d，培養完成後收集培養液；
[0022] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養液。
[0023] 所述方法用於製備鹿茸骨膜組織條件培養液。
[0024] 本發明所取得的有益效果如下：
[0025] 1)本發明所提供的方法能夠使鹿骨膜組織在離體培養條件下分泌活性物質，進而 收集、分析所分泌的活性物質，解決了活體條件下很難分離、分析某些組織所分泌的含量極 少的，分子很小的而又起到很關鍵作用的活性物質的難題。
[0026] 2)本發明所提供的方法能夠有效提高培養組織的成活率，並縮短組織的培養時 間。
[0027] 3)本發明所提供的方法可以實現隨時收集條件培養液和更換新鮮培養液，操作十 分方便。

【專利附圖】

【附圖說明】
[0028] 圖1為本發明所用動物組織切割器；
[0029] (A為切割臺；B.為切割器，由20個左右的刀片平行放置，每兩個刀片中間用 0· 7mm厚的隔板間隔開；C為裝卸板手）。
[0030] 圖2為本發明所用插入皿和多孔細胞培養板；
[0031] (a，為與24孔細胞培養板結合使用的插入皿，其底部為孔徑0. 4um的滌綸樹脂膜。 使插入皿和細胞培養板間有液體的聯通；b，為與6孔細胞培養板結合使用的插入皿，其底 部為孔徑0. 4um的滌綸樹脂膜，插入皿和細胞培養板間有液體的聯通）。
[0032] 圖3為實施例1-4條件培養液促使SK-N-SH細胞向神經元分化的結果；
[0033] (a，實施例1 ;b，實施例2 ;c，實施例3 ;d，實施例4)。
[0034] 圖4為實施例1-4條件培養液促進大鼠背根神經節軸突向外生長的結果；
[0035] (a，實施例1 ;b，實施例2 ;c，實施例3 ;d，實施例4)。
[0036] 圖5為實施例1-4條件培養液促進大鼠背根神經節的神經元軸突生長的結果；
[0037] (a，實施例1 ;b，實施例2 ;c，實施例3 ;d，實施例4)。

【具體實施方式】
[0038] 下面結合具體實施例對本發明做進一步說明，但本發明不受實施例的限制。
[0039] 實施例1
[0040] 本發明提供了一種利用三角瓶培養鹿角柄骨膜組織製備條件培養液的方法，步驟 如下：
[0041] 1)利用動物組織切割器（圖1)將活體採集的鹿骨膜組織切割成長6_，寬2_，厚 1. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0042] 2)將20片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入三角瓶中。
[0043] 3)向三角瓶中加入神經培養液，充入飽和濃度的C02濃度，塞緊三角瓶，放到培養 箱中培養4d，培養完成後收集培養液；
[0044] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養液。
[0045] 實施例2
[0046] 本發明提供了一種鹿生茸區骨膜組織條件培養液的製備方法，步驟如下：
[0047] 1)利用動物組織切割器將活體採集的鹿生茸區骨膜組織切割成長3mm，寬2mm，厚 0. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0048] 2)將15片步驟1)所得的骨膜組織切片均勻地放入用鼠尾膠原包被好的插入皿 中，再將插入皿放到24孔培養板（圖2a)的孔中；
[0049] 3)向插入皿和24孔培養板中，即培養的上室和下室中分別加入神經培養液，於 37°C、C0 2濃度5%，飽和溼度的條件下培養3d，培養完成後收集培養液；
[0050] 4)利用0.22 μ m的濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養 液。-80°C保存備用。
[0051] 實施例3
[0052] 本發明提供了一種鹿角柄骨膜組織條件培養液的製備方法，步驟如下：
[0053] 1)利用動物組織切割器將活體採集的鹿角柄骨膜組織切割成長3mm，寬2mm，厚 0. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0054] 2)將50片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用鼠尾膠原包被好的插入皿中，再將 插入皿放到6孔培養板的孔中；
[0055] 3)向插入皿和6孔培養板（圖2b)中加入神經培養液，於37°C、C02濃度5%，飽 和溼度的條件下培養3d，培養完成後收集培養液；
[0056] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養液。
[0057] 實施例4
[0058] 本發明提供了一種鹿生茸區骨膜組織條件培養液的製備方法，步驟如下：
[0059] 1)利用動物組織切割器將活體採集的鹿生茸區骨膜組織切割成長3_，寬2_，厚 〇. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片；
[0060] 2)將60片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用I型膠原包被好的插入皿中，再將 插入皿放到6孔培養板的孔中；
[0061] 3)向插入皿和6孔培養板中加入神經培養液，於37°C、C02濃度5%，飽和溼度的 條件下培養3d，培養完成後收集培養液；
[0062] 4)利用0. 22 μ m的濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得鹿茸骨膜組織條件培養液。
[0063] 實施例5
[0064] 本實施例對實施例1-4所製備的條件培養液進行活性檢測：
[0065] 以下實驗為利用本發明的實施例1-4所獲得的條件培養液分別培養SK-N-SH細 胞、大鼠15日齡胚胎背根神經節以及背根神經節神經元，結果如圖3-5所示。其中圖3為實 施例1-4條件培養液促使SK-N-SH細胞向神經元分化的實驗結果；圖4為實施例1-4條件 培養液促進大鼠背根神經節軸突向外生長的實驗結果；圖5為實施例1-4條件培養液促進 大鼠背根神經節的神經元軸突生長的實驗結果。從以上圖中可以看出，利用本發明製備的 角柄骨膜組織條件培養液中含有角柄骨膜組織分泌的生物活性分子，能夠促進神經生長。 表1為實施例1-4所製備條件培養液的效果。
[0066] 表1實施例1-4所製備條件培養液的效果
[0067]

【權利要求】
1. 一種鹿骨膜條件培養液的製備方法，其特徵在於，將鹿骨膜組織切片後置於插入皿 中，向插入皿中加入培養液培養，培養後收集培養液，過濾後獲得條件培養液； 所述插入皿底部由0. 4 μ m孔徑的滌綸樹脂製成，培養時放入多孔細胞培養板中，將培 養空間分為上室和下室，上室和下室之間有培養液聯通。
2. 權利要求1所述製備方法，其特徵在於，步驟如下： 1) 利用動物組織切割器將活體採集的鹿骨膜組織切割成薄片，獲得骨膜組織切片； 2) 將步驟1)所得的骨膜組織切片，放入用鼠尾膠原或I型膠原包被的插入皿中，再將 插入皿放到多孔培養板的孔中； 3) 向插入皿和培養板中加入液體培養液培養，培養完成後收集培養液； 4) 用濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得條件培養液。
3. 權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟1)所述骨膜組織切片，長2-6mm，寬 1. 5_2mm,厚 0· 2-1. 7mm 〇
4. 權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟2)所述骨膜組織切片放入插入皿，是將 10-100片骨膜組織切片放入到用鼠尾膠原或型膠原包好的插入皿中；所述插入皿底部由 孔徑為0. 4 μ m的滌綸樹脂製成，放入培養板後，將培養空間分為上室和下室，且上室和下 室之間有培養液聯通；所述多孔培養板，培養孔的數量為24,12,或6個。
5. 權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟3)所述液體培養液為神經培養液，具體組成 為：neurobasal medium 加入 2% 的 B27 supplement 再加 1% 的抗生素。
6. 權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟3)所述培養，培養溫度為37°C，C02濃度為 5%，飽和溼度，培養時間為2-4d。
7. 權利要求2所述方法，其特徵在於，步驟4)所述濾膜過濾，是利用0. 22 μ m的濾膜進 行過濾。
8. 權利要求2所述方法，其特徵在於，具體步驟如下： 1) 利用動物組織切割器將活體採取的鹿骨膜組織切割成長2-6mm，寬1. 5-2mm，厚 0. 2-1. 7mm的薄片，獲得骨膜組織切片； 2) 將10-100片步驟1)所得的骨膜組織切片，放入包被好的插入皿中，再將插入皿放到 多孔培養板的孔中； 3) 向插入皿中加入神經培養液，於37°C、5% C02濃度，飽和溼度的條件下培養2-4d，培 養完成後收集培養液； 4) 利用0. 22 μ m的濾膜過濾步驟3)所得培養液，獲得鹿骨膜組織條件培養液。
9. 權利要求1-8所述方法，用於製備鹿骨膜組織條件培養液。
【文檔編號】C12N5/071GK104152400SQ201410401158
【公開日】2014年11月19日 申請日期:2014年8月15日 優先權日:2014年8月15日
【發明者】李春義, 王文英, 孫紅梅 申請人:中國農業科學院特產研究所