肝癌細胞抑制劑的製作方法

2023-05-08 13:02:01 2

專利名稱：肝癌細胞抑制劑的製作方法
技術領域：
本發明提供了一種醫藥組合物，具體地說，是一種含有芝麻素的藥物組合物，以及芝麻素(sesamin)用於治療肝癌的新用途，更特別地，是關於芝麻素做為肝癌細胞抑制劑的用途，並揭示了芝麻素藉助活化癌症抑制基因P33表現的抑制肝癌細胞增生的藥理作用。
背景技術：
肝癌是生長在肝臟中的惡性腫瘤，由於擴散較快、惡性程度較高早期不易被查覺，等到出現症狀再去找醫生時，往往已為時太晚，確立診斷半年至一年內患者就會死亡，因此有人談肝癌色變，稱它為「癌中之王」。
近年來通過對其病因學調查，早期診斷方法的建立以及手術、化療和免疫療法的進步，在肝癌的預防和治療方面有非常大的進展。
肝癌在世界各地都有發生，但主要集中在亞洲和非洲，非洲撒哈拉沙漠以南、東南亞以及中國沿海一帶(例如長江下遊一帶的啟東、海門、崇明、南匯以及廣西的扶綏等地)，為肝癌的高發區，而歐、美、大洋洲各洲肝癌發病率較低，與上述高發地區相比竟相差數百倍之多。
芝麻子和芝麻油已廣泛被當作日常生活中的傳統健康食品，在中醫古籍中認為芝麻具有補肝腎、潤五臟、明目、益氣力及長肌肉等的療效。
而芝麻素是芝麻子中所含的一種木脂素，只佔芝麻子的0.5％，最近幾年的研究指出，芝麻素具有抗高血壓與心血管肥大、保護肝臟因連續飲酒造成的損傷、抗氧化、抗炎以及降低膽固醇等功效(參見日本專利申請04-009331；菅野與秋元，中國營養協會期刊181-11(1993)及Utsunomiya T等人，Hepatogast.，501609-13(2003))。

發明內容
本發明以人類肝癌細胞HepG2做為試驗模式，研究了芝麻素對肝癌細胞增生的抑制作用，並藉助芝麻素誘導P53蛋白質表現量增加的實驗，進一步探討了芝麻素對於抑制肝癌細胞的可能作用機制。
本發明的目的在於提供一種肝癌細胞抑制劑，其含有芝麻素，該芝麻素可抑制患者體內肝癌細胞的增生。
本發明的目的還在於提供一種用於治療人類肝癌的醫藥組合物，其特徵在於包含芝麻素作為活性成分。
本發明的目的還在於提供關於芝麻素做為肝癌細胞抑制劑的用途，特別是一種有關於芝麻素用於治療人類肝癌的用途。
為達到上述目的，本發明提供了一種肝癌細胞抑制劑，其包含芝麻素作為該抑制劑的活性成分。
本發明還提供了一種用於治療人類肝癌的醫藥組合物，其包含芝麻素作為活性成分。
本發明還提供了一種促進肝癌細胞中癌症抑制基因p53表現的醫藥組合物，其特徵在於該組合物中含有芝麻素。
本發明所述的肝癌細胞抑制劑，其中所含有的芝麻素可誘導肝癌細胞中p53蛋白質的活化，進而抑制肝癌細胞增生。
本發明在現有研究的基礎上，進一步探討芝麻素抑制肝癌細胞增生與其誘導活化癌症抑制基因p53產物表現之間的關係，由此驗證了芝麻素用於治療人類肝癌方面的實用性，並製成了含有該芝麻素的肝癌細胞抑制劑。
肝細胞「癌」，其意為由肝細胞惡性化所形成的肝臟惡性腫瘤(「瘤」這個字包括了良性腫瘤及惡性腫瘤，惡性腫瘤即稱為「癌」)。癌症細胞是由身體細胞突變轉形所造成的，在正常情況下每一個細胞的生長、分化、增生及死亡均有一連串嚴謹的基因調控過程，人藉此維持個體細胞數量及功能上的恆定。通常癌症發生和兩群特殊調控細胞生命周期基因有關，一群叫做致癌基因(oncogenes)，另一群則為癌症抑制基因(cancer suppressorgenes)；致癌基因的產物在功能區分上可以是生長因子(growth factor)/生長因子受體(growth factor receptor)以及細胞訊息因子(signal transductionfactor)，而抑制基因的產物則常與細胞周期調控有關，最有名的是P53，其功能為遏止細胞進入細胞周期的S期，最近的研究更發現p53可引導受損細胞進入細胞凋亡(apoptosis)的機轉，兩者皆可減除癌細胞新生的機會。
正常情況下，致癌基因的表現會受到癌症抑制基因限制，恰到好處地扮演促進正常細胞生長或新陳代謝的角色，因此致癌基因不致失控誘發癌症的發生。一旦癌症抑制基因DNA突變調控失常(遺傳或致癌物的刺激，有些病毒亦會直接或間接引發基因失調)，無法有效地壓制致癌基因，或者致癌基因受到病毒或其它致癌物的刺激而不再受抑癌基因約束，導致細胞無法繼續正常調控其生長分化，此種轉型失控的細胞就是癌細胞。這些細胞有可能因受到免疫系統抑制或其它原因在身心內潛伏數十年之久而沒有表現其侵略蔓延性，可是當這些失控細胞脫離正常調控軌道而快速生長或喪失細胞凋亡的機制而長生不死時，就有可能在人體內經血液循環系統或淋巴系統途徑而四處衍生，發生轉移(metastasis)進而造成人體的死亡。因此癌症可說是來自多種病因，導致人體內一些轉型細胞失控的擴張，長期發展出來的一種慢性病(例如肝癌)，隨著年齡增長得癌症的機會愈大。
目前所知有80％以上的癌症，是因P53壞掉而產生的，p53之所以重要，主要是因為它具有3個功能1.令細胞不要再生長，專心從事修補受損DNA的工作(growth arrest)。2.無法修補時，令細胞自殺(凋亡)。3.抑制血管增生(anti-angiogensis)，不供給癌細胞養分，使癌細胞無法長大、轉移。因為p53也是個基因，當然會受到外界損壞，且當它受外界損壞時，即無法修補並喪失上述三種功能，癌細胞就易產生。
芝麻油中除主要所含的X6脂肪酸外，尚含有一些對身體健康有益的木脂體(lignans)，包括芝麻素(sesamin)、芝麻醇素(sesamoil)、芝麻酚(sesaminol)、表芝麻素(episesamin)與表芝麻酚(episesaminol)。
本發明主要提供了芝麻素用於抑制人的肝癌細胞的新用途，在本發明的具體實施例中，藉助芝麻素處理(10及50μM)對人類肝癌細胞Hep-G2細胞的增生、存活度、細胞毒素以及對肝癌細胞中p53含量的影響等測試結果，證明芝麻素用於抑制人類肝癌的功效，進而完成本發明的含有芝麻素的醫藥組合物，即肝癌細胞抑制劑。
細胞存活度藉由測量MTT(3-(4，5-二甲基-唑-2-基)-2，5-二苯基溴化四唑，即唑藍)還原作用測定(也是單核細胞直接細胞毒性測定)得，而其活細胞中無色MTT會經由線粒體的脫氫代謝成藍色formazan，藉由測量反應後的吸光值，即可反映出確切的存活細胞量。
細胞毒素藉由測量培養物中受損細胞的LDH(乳酸脫氫)釋出量而測得，而其芝麻素對G2細胞的細胞毒性會使G2細胞因受損或死亡而釋放出LDH，當細胞培養物上的培養物上清液中LDH含量相較於對照組增高時，即表示芝麻素對G2細胞產生細胞毒性，造成G2細胞破壞而釋放出LDH。
本領域技術人員可以適當方式以及常規技術，例如披露於雷明頓醫藥科學，1985或雷明頓醫藥科學，吉納羅編著，麥克出版公司，伊斯頓，PA，1990或雷明頓醫藥的料學與慣常技術，第19板(1995)實現製備該等組合物，例如膠囊、片劑、溶液、懸浮液或局部塗覆劑。
所使用的醫藥載體或稀釋劑可為已知的固體或液體載體，固體載體例如乳糖、石膏粉、蔗糖、環糊精、滑石、明膠、瓊脂、果酸、阿拉伯膠、硬脂酸鎂、硬脂酸或纖維素的低級(低碳數)烷基醚類；液體載體例如糖漿、花生油、橄欖油、磷脂類、脂肪酸、脂肪酸醯胺類、聚氧乙烯或水。
同樣，載體或稀釋劑可包括任何已知用於本領域的持續釋放材料，例如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯，可單獨使用或與蠟混合。
本發明的組合物(抑制劑)通常適用於口服給藥。對於口服給藥，是將芝麻素和/或芝麻醇藥素製備呈適於口服給藥的形式，例如片劑或膠囊；代表性地，將化合物I與載體混合，並壓模成形為片劑，用於此劑型的適宜載體包括澱粉、糖類、磷酸二鈣、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂等，而此類組合物可進一步包括一種或多種輔助物質，例如溼潤劑、乳化劑、防腐劑、安定劑、著色添加劑等。
醫藥組合物每日或每星期可進行給藥一或多次，該組合物的有效量為可提供臨床顯著功效的量，該量將(一部份)視所欲治療的特殊病況、患者的年齡、體重與一般建康狀況及其它本領域所熟知的因素而定。
優選的單位劑量形式可以包括固體形式(片劑或膠囊)，液體形式(溶液、懸浮液、乳液、酏劑或充以該等形式的膠囊)，或滅菌可注射溶液形式。
本發明的組合物也可藉由古醫藥學派的已知方法配製而得。
現有賦形劑為適用於非經腸道或口服施用，且不會與活性化合物產生有害反應的醫學上可接受的有機或無機載體物質。
此類載體的實例為水、鹽類溶液、醇類、乙二醇類、聚羥基乙氧基化篦麻油、糖漿、花生油、橄欖油、明膠、乳糖、石膏粉、蔗糖、瓊脂、果酸、阿拉伯膠、澱粉糖、硬脂酸鎂、滑石、矽酸、硬脂酸、脂肪酸單甘油酯類，季戊四醇脂肪酸酯類、羥甲基纖維素與聚乙烯基吡咯酮及磷酸鈣。
醫藥製劑可經滅菌，並(若需要)與不會和活性化合物產生有害反應的輔助劑，例如粘著劑、潤滑劑、防腐劑、崩解劑、安定劑、溼潤劑、乳化劑、用於影響滲透壓的鹽類、緩衝劑和/或著色物質等混合，對於非經腸道給藥，優選為可注射用溶液或懸浮液，較優選為具有溶於聚羥基化篦麻油中的活性化合物的水溶液。
對於口服投藥，優選為具有滑石及/或碳水化合物載體或粘著劑等類的片劑、糖錠劑或膠囊，該載體優選為乳糖或磷酸鈣及/或玉米澱粉及/或馬鈴屬澱，當使用甜味賦形劑時，可使用糖漿、配劑或類似物。


圖1芝麻素對Hep-G2細胞存活率的影響；
圖2Hep-G2細胞的顯微照片，(A)為未經處理對照組；(B)為經50μM芝麻素處理2天的G2細胞；圖3藉助MTT還原分析測定芝麻素對Hep-G2細胞存活率的影響；圖4藉助乳酸脫氫(LDH)釋出分析測定芝麻素對Hep-G2細胞的細胞毒性；圖5列於G2細胞中由芝麻素所誘導的p53活化作用；其中，第1列為未經處理的G2對照組；第2列為經10μM芝麻素處理的實驗組；第3列為經50μM芝麻素處理的實驗組。
具體實施例方式
以下結合附圖詳細說明本發明，但不限定本發明的實施範圍。實施例中所有數據皆以平均值±SEM表示，對於單一存活比較，使用Student’s測試。對於多數存活比較，將數據以Scheffe’s測試後進行的差異單向分析(ANOVA)進行分析。
實施例1.芝麻素對肝癌細胞Hep-G2的致害作用A.芝麻素的萃取將200ml芝麻油溶解於1500ml丙酮中並儲放於-70℃下過夜，將經固化的三醯甘油丟棄，並將丙酮溶液經過濾收集，待去除丙酮後將油層以25ml含有氫氧化鉀的乙醇進行皂化1小時，將未皂化部分以蒸餾水透析並以乙醚萃取三次，待經另次過夜乙醚萃取後，獲得含有90％芝麻素與10％芝麻醇素的白色結晶粉末，將粗製混合物溶解於氯仿-乙醇(9∶1)進行製備型薄層層析以分離芝麻素與芝麻醇素(Rf值分別為0.58及0.69)。根據Kamal-Eldin等人(J Am Oil Chem Soc，71；141-147(1994))所述的方法以HPLC測定各物質的純度。
B、芝麻素對G2細胞的生長抑制將HepG2細胞(起始細胞數為5×105)與含不同濃度(10、50μM)芝麻素及不含芝麻素(對照組)的培養基處理1-4天，並於第0、1、2、3及4天取樣細胞計數存活細胞數量，結果列示於圖1，並由結果(表1)顯示，經芝麻素處理的G2細胞相較於對照組，其不僅增生受到抑制，而且存活細胞數亦隨著芝麻素處理時間增加而減少。
表1、芝麻素對Hep-G2細胞存活率的影響

另外，由圖2所示的顯微照片顯示，經50μM芝麻素處理2天的G2細胞比較時，其增生已顯著受到抑制，見表2。
表2、乳酸脫氫(LDH)釋放分析Hep-G2細胞毒性(細胞毒性，OD值)

C.以MTT分析測定芝麻素對G2細胞存活度的影響將G2細胞以5×105細胞每槽的密度預先培育於6-槽平盤中達24小時，然後以磷酸鹽緩衝食鹽水(PBS)漂洗，將HePG2細胞(起始細胞數為5×105)與含不同濃度(10、50μM)芝麻素及不含芝麻素(對照組)的培養基處理1-4天，並於37℃下生長於0.5mg/ml MTT中，經六十分鐘後，將200ML溶解溶液加入各槽中，於540nm下於自動化SpectraMax 340(Molecular，Sunnyvale，CA，USA)微量滴定平盤計讀器上讀取吸光值，結果列於圖3，所示數據為相對於對照組細胞的平均存活細胞百分比，由MTT還原分析結果亦顯示芝麻素可顯著地減低G2細胞的存活度，表示其具有抑制G2細胞生長及增殖功效。
D.以LDH釋放分析測定芝麻素對G2細胞的細胞毒性將G2細胞以不同濃度(10、50μM)芝麻素處理1-4天，並收取培養物上清液進行LDH活性分析。首先將0.1ml不含細胞的上清液與含有NADH及丙酮酸鈉的磷酸鉀緩衝液以最終體積為0.2ml混合併加至93槽平盤。於490/630nm下於自動化SpectraMax340微量滴定平盤計讀器上讀取吸光值比。結果列於圖4，所示數據以相對於H2O2或Hhypoxia對照組的平均存活細胞百分比表示。由細胞毒性分析結果顯示，G2細胞在與10或50Mm芝麻素培育2天後(B)，其細胞毒性損害相較於對照組(A)顯著增加，亦正面證實芝麻素對肝癌細胞G2具有細胞毒性功效。
實施例2.芝麻素誘導癌細胞Hep-G2的p53蛋白質活化作用藉助西方點漬分析測定由芝麻素所誘導G2細胞中p53產物表現。將培養基從培養皿中移除並將細胞以冰溫PBS洗兩次。將細胞以橡膠刮刀刮下，並於4℃、200×g下離心10分鐘。將細胞沉澱再懸浮於適量(使濃度達約4×107細胞/mL)溶解緩衝液(20mM Tris-HCl，pH7.5、137mM NaCI、1mM苯甲基磺醯氟(PMSF)、10μg/ml抑蛋白酶、10μg/mL亮抑蛋白酶及5μg/mL抑胃蛋白酶A)中，並施予超音波震碎。以Bradford分析(Bio-Rad，Hemel，Hempstead，UK)測定樣本中蛋白質濃度，並將樣本以溶解緩衝液定量至2mg/ml。
將所得含有50μg蛋白質的蛋白質樣本置於12％的十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠分離，並轉移至Immobilon聚二氟乙烯膜(Millipore，Bedford，USA)上。將該膜與5％混於TBST緩衝液(0.1M Tris-HCl，pH7.4、0.9％NaCl、0.1％Tween-20)的脫脂奶粉培育1小時以阻斷非-特異性結合。然後將膜與小鼠抗-p53(1∶2000，Calbiochem，聖地牙哥，CA，USA)進行反應。接著，將膜與次級抗體鏈親和素-辣根過氧化-共軛的親和性山羊抗-小鼠IgG(Jackson，West Grove，PA，USA)反應。以化學發光偵測系統根據製造廠商(ECL，Amersham，Berkshire，UK)的指示測定p53蛋白質。以密度計量掃描器(PDI，Huntington Station，NY，USA)定量條帶密度。結果列於圖5(見表3)。由該西方轉漬分析結果顯示，相較於未經處理的G2細胞，與10或50μM芝麻素培育2天的G2細胞中p53蛋白質含量含量顯著增多，因此結合前述的細胞存活結果，可推斷芝麻素抑制肝癌細胞G2的增生可能是藉助活化p53蛋白製造的機制。
表3、MTT還原分析測定的細胞(細胞生存，OD值)

綜上所述，芝麻素可顯著抑制肝癌細胞生長及增生，有效提高肝癌細胞中的p53表現，藉此對肝癌細胞產生細胞毒性，促進肝癌細胞的細胞凋亡，達到治療肝癌的目的。
權利要求
1.一種用於治療人類肝癌的醫藥組合物，其特徵在於包含芝麻素作為活性成分。
2.如權利要求1所述的醫藥組合物，其中該芝麻素抑制患者體內肝癌細胞的增生。
3.一種促進肝癌細胞中癌症抑制基因p53表現的醫藥組合物，其特徵在於包含芝麻素。
全文摘要
本發明提供了一種含有芝麻素的肝癌細胞抑制劑，和關於芝麻素(sesamin)用做肝癌抑制劑的用途；更特別地，提供了芝麻素藉助活化癌症抑制基因p53表現的機制，從而抑制肝癌細胞增生。
文檔編號A61P35/00GK1810239SQ200510002840
公開日2006年8月2日 申請日期2005年1月25日 優先權日2005年1月25日
發明者侯建維, 黃文田 申請人:喬志亞生技股份有限公司