北五味子誘導不定芽的方法

2023-04-27 11:01:06

專利名稱：北五味子誘導不定芽的方法
技術領域：
本發明涉及的是一種農業技術領域的組織培養方法，具體是一種北五味子誘 導不定芽的方法。
技術背景組織培養是加速植物繁殖、創造優良品種的一種行之有效的方法，為農業生 產提供許多優良的新品種，也為農業生產工廠化提供了廣闊的前景。MS培養基， 6-BA， NAA， ZT的選用在誘導不定芽萌發和不定芽增殖中己經得到肯定。北五味子這一中國傳統著名的藥材近年來在國外受到相當的關注，其含有大 量的精油、酸等液體物質，具有增強視力和聽力能力，消除眼部疲勞，加強視力 集中，增強機體免疫能力，提高抵抗力等功能。因此北五味子可以成為一些特殊 職業的必備良藥，諸如長途駕駛司機、飛行員、航海員和運動員等都可以用它來 緩解工作過程中的巨大壓力。經對現有技術的文獻檢索發現，陳雅君等在《植物研究》(1999， 7, 19(3): 318-322)上發表的《藥用植物北五味子的組織培養》該文中提出以帶腋芽的北 五味子嫩莖為外植體，在附加6-BA2.。+ZT。」mg/L的MS培養基上，誘導芽的效果最好。 其具體方法為把北五味子嫩莖剪去葉片及葉柄，用自來水衝洗，並加少量市售 洗衣粉加以洗滌，用自來水衝洗4 5小時，然後切成約5cm長的莖段移到超淨工 作臺上，先用70%酒精浸泡30秒，再用0.2%溶液消毒8分鐘，取出後用無菌水衝洗 5次，切成長度約O. 5cm左右的小段，每段至少有一個葉腋，按無菌操作要求， 接種於培養基上。將培養瓶置於20 26。C，光照強度為2000Lx的培養室，光照時 間每天為12小時。其不足在於升汞溶液有劇毒，對植物材料損傷大，對人體有 危害性，處理不當對環境有汙染，不適宜實際應用。發明內容本發明針對現有技術的不足，提供一種北五味子誘導不定芽的方法，使其提 供北五味子組培快繁的不定芽誘導所需要的最佳培養基和外植體消毒方法，為優提供了技術保證，將對北五味子資源的開發和利用起到積 極的推動作用。本發明是通過以下技術方案實現的，本發明包括如下具體步驟① 取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養的外植體材料；② 採用間二滅菌法對外植體材料消毒； (D在誘導培養基上培養獲得無菌叢生芽；④叢生芽經過分株後再接種於誘導培養基上培養獲得大量不定芽。所述採用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指用飽和的次氯酸鈉浸泡消毒 後接種於誘導培養基上，隔一天後再用次氯酸鈉消毒一次。進一步的，所述採用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指剪取2cm長的帶 腋芽的嫩莖段，自來水水衝洗2小時後用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發 白，取出用無菌水衝洗三次以上，然後用無菌紗布吸乾水分，通過無菌操作接種 於誘導芽的培養基上，隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次， 以獲得高質量的無菌北五味子外植體材料。所述在誘導培養基上培養獲得無菌叢生芽，其培養室溫度20。C -25°C，光照 12h/d，光照強度800-12001x。經過20天-30天的培養，北五味子莖段會生長出腋 芽。所述叢生芽經過分株後再接種於培養基上培養，是指長出腋芽後繼續培養 20天左右，待腋芽長到2cm後，將不定芽從外植體上切下，接種到誘導培養基上 培養。在剪取不定芽時，儘量選擇腋芽莖段，因為該部位在繼代培養中是最容易 誘導出更多的不定芽。等待不定芽長成芽叢後，再將不定芽切下分株繼續擴大繁 殖，直至到達所需數量。所述誘導培養基，其成分為每升液體MS基本培養基中加6-苄氨基嘌呤 2.0mg、 a-萘乙酸0.05mg、玉米素0. 06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。本發明對於外植體的消毒採用了間二滅菌法，原因在於培養的植物材料大都 採集于田間栽培植株，材料上常附有各種微生物， 一旦被帶入培養基，即會迅速 繁殖滋長，造成汙染，而接種到培養基上之後兩天是孢子體生命力最弱的階段， 此時將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，接種到培養基上後，汙 染率小於5%，且外植體腋芽萌發率高，相對於傳統的一次滅菌方法，能取得更好的滅菌效果，而且次氯酸鈉相對於其他消毒劑更易於去除，不易殘留在外植體 上對其造成損傷。本發明中培養基附加了低濃度的NAA，其作為一種生長素，主要作用是重新啟動有絲分裂，使已停止分裂的植物細胞恢復分裂能力。在北五味子不定芽誘導的實驗中，低濃度的NAA與6-BA組合，效果比不加NAA要好。不定芽平均增殖係數達到3.4，最高4. 1，比前人所作有大幅提高。
具體實施方式
下面對本發明的實施例作詳細說明本實施例在以本發明技術方案為前提下 進行實施，給出了詳細的實施方式和具體的操作過程，但本發明的保護範圍不限 於下述的實施例。本實施例所使用的誘導培養基，通過以下方法製成每升液體MS基本培養基 中加6-BA(6-節氨基嘌呤)2. 0mg、 NAA( a-萘乙酸)0. 05mg、 ZT (玉米素)0. 06mg、蔗糖30g， pH值調為5. 8後每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min製成固體培養基。 實施例1剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水衝洗2小時後用飽和的次氯酸鈉浸泡 三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水衝洗三次以上，然後用無菌紗布吸乾水分， 通過無菌操作接種於誘導芽的培養基上(每升液體MS基本培養基中附加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2.0mg、 NAA(a-萘乙酸)0.05mg、 ZT (玉米素)0. 06mg、蔗糖30g， pH 值調為5.8後每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min製成固體培養基)IOO個，隔一天將 外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次後重新接種於誘導培養基上，在 溫度20"C，光照12h/d，光照強度12001x條件下培養。經過20天的培養，北五味 子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm後，選取60個腋芽從外植體上切下，接種 到上述培養基上繼續培養，30天後統計不定芽數量為211個，增殖係數為3.52。實施例2剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水衝洗2小時後用飽和的次氯酸鈉浸泡 三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水衝洗三次以上，然後用無菌紗布吸乾水分， 通過無菌操作接種於誘導芽的培養基上(每升液體MS基本培養基中附加6-BA(6-苄氨基嘌呤)1.5mg、 NAA(a-萘乙酸)0.03mg、 ZT (玉米素)0. 04mg、蔗糖30g， pH 值調為5.8後每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min製成固體培養基)IOO個，隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次後重新接種於誘導培養基上，在 溫度25。C，光照12h/d，光照強度8001x條件下培養。經過25天的培養，北五味子 莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm後，選取60個腋芽從外植體上切下，接種到 上述培養基上繼續培養，30天後統計不定芽數量為166個，增殖係數為2.76。 實施例3剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來水水衝洗2小時後用飽和的次氯酸鈉浸泡 三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水衝洗三次以上，然後用無菌紗布吸乾水分， 通過無菌操作接種於誘導芽的培養基上(每升液體MS基本培養基中附加6-BA(6-苄氨基嘌呤)2. 5mg、 NAA(a-萘乙酸)0.07mg、 ZT (玉米素)0. 08mg、蔗糖30g， pH 值調為5.8後每升加入8g瓊脂12rC滅菌30min製成固體培養基)IOO個，隔一天將 外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次後重新接種於誘導培養基上，在 溫度22t，光照12h/d，光照強度10001x條件下培養。經過26天的培養，北五味 子莖段會生長出腋芽。待腋芽長到2cm後，選取60個腋芽從外植體上切下，接種 到上述培養基上繼續培養，30天後統計不定芽數量為175個，增殖係數為2.92。
權利要求
1、一種北五味子誘導不定芽的方法，其特徵在於，包括如下具體步驟①取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養的外植體材料；②採用間二滅菌法對外植體材料消毒；③在誘導培養基上培養獲得無菌叢生芽；④叢生芽經過分株後再接種於誘導培養基上培養獲得大量不定芽；所述誘導培養基，其成分為每升液體MS基本培養基中加6-苄氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。
2、 根據權利要求1所述的北五味子誘導不定芽的方法，其特徵是，所述誘 導培養基，其pH值為5.8。
3、 根據權利要求1所述的北五味子誘導不定芽的方法，其特徵是，所述採 用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指用飽和的次氯酸鈉浸泡消毒後接種於誘 導培養基上，隔一天後再用次氯酸鈉消毒一次。
4、 根據權利要求1或3所述的北五味子誘導不定芽的方法，其特徵是，所述 採用間二滅菌法對外植體材料消毒，是指剪取2cm長的帶腋芽的嫩莖段，自來 水水衝洗2小時後用飽和的次氯酸鈉浸泡三分鐘，至兩端發白，取出用無菌水衝 洗三次以上，然後用無菌紗布吸乾水分，通過無菌操作接種於誘導芽的培養基上， 隔一天將外植體從培養瓶中取出，再用次氯酸鈉消毒一次，以獲得高質量的無菌 北五味子外植體材料。
5、 根據權利要求l所述的北五味子誘導不定芽的方法，其特徵是，所述在誘 導培養基上培養獲得無菌叢生芽，其培養室溫度20°(:-25°(:，光照12h/d，光照強 度8001x -12001x，經過20天-30天的培養，北五味子莖段會生長出腋芽。
6、 根據權利要求l所述的北五味子誘導不定芽的方法，其特徵是，所述叢生 芽經過分株後再接種於培養基上培養，是指長出腋芽後繼續培養20天，待腋芽 長到2cm後，將不定芽從外植體上切下，接種到誘導培養基上培養，在剪取不定 芽時，選擇腋芽莖段，等待不定芽長成芽叢後，再將不定芽切下分株繼續擴大繁 殖，直至到達所需數量。
全文摘要
本發明是一種農業技術領域的北五味子組培快繁的不定芽誘導方法，取北五味子的嫩枝頂部和中部帶腋芽莖段作為組織培養外植體，採用飽和次氯酸鈉間二滅菌法對外植體消毒，無菌操作接種於誘導培養基上，誘導培養基成分為每升液體MS基本培養基中加6-苄氨基嘌呤2.0mg、α-萘乙酸0.05mg、玉米素0.06mg、蔗糖30g、瓊脂8g。在溫度20℃-25℃，光照12h/d，光照強度800-1200lx條件下培養。經過20天-30天的培養，北五味子莖段會生長出腋芽，繼續培養待腋芽長到2cm後，將不定芽從外植體上切下，接種到新的培養基上培養獲得無菌叢生芽，叢生芽經過分株後再接種於培養基上培養可獲得大量不定芽。
文檔編號A01H4/00GK101228847SQ20081003222
公開日2008年7月30日 申請日期2008年1月3日 優先權日2008年1月3日
發明者劉群錄, 高 王, 申曉輝, 範愷敏, 範現麗 申請人:上海交通大學