山羊lyrm1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
2023-05-10 03:58:31 2
山羊lyrm1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法及檢測試劑盒的製作方法
【專利摘要】本發明公開了山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法及檢測試劑盒，以包含LYRM1基因的待測山羊全基因組DNA為模板，PCR擴增山羊LYRM1基因部分序列，然後進行聚丙烯醯胺凝膠電泳；根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果鑑定山羊LYRM1基因第8793位為G或T的鹼基多態性。本發明提供了一種用簡單、快速、低成本、精確度高的檢測方法，便於推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與山羊生長性狀密切相關的遺傳標記，可用於山羊的輔助選擇和分子育種。
【專利說明】山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法及檢測試 劑盒
【技術領域】
[0001] 本發明涉及基因單核苷酸多態性（SNP)的檢測，特別涉及山羊LYRM1基因單核苷 酸多態性位點的檢測。
【背景技術】
[0002] 單核苷酸多態性（SNP)指基因組DNA序列中由於單個核苷酸（A/T/C/G)的替換而 引起的多態性，主要由單個鹼基的轉換或者顛換所引起。具有轉換型變異的SNPs約佔2/3， 其他幾種SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因組中最易發生突變的位點，其 中大多數是甲基化的，可自發地脫去氨基而形成胸腺嘧啶。
[0003] 根據對遺傳性狀的影響，基因多態性又可分為兩種：一種是同義突變多態性，即 SNP所致編碼序列的改變並不影響其所翻譯的蛋白質中胺基酸序列，突變鹼基與未突變鹼 基的"含義"相同；另一種是非同義突變多態性，即鹼基序列的改變將導致編碼胺基酸的改 變，從而廣生蛋白質序列的改變，可能最終影響到蛋白質的功能。因此，對編碼區SNPs的非 同義突變來說，它們可能對基因功能有直接的重要影響；尤其對於無義密碼子突變來說，更 可能會導致所編碼的蛋白發生重大變化，從而影響它的功能發揮，對個體的表現型產生重 要影響。不僅如此，在群體遺傳研宄中，這些SNPs作為遺傳標記在群體遺傳和生物進化的 研宄中也具有重要意義。
[0004] 近年來，人們發展了許多用於探尋分子遺傳標記的方法，最常見的有單鏈構象多 態技術（SSCP)、限制性片段長度多態性聚合酶鏈反應（PCR-RFLP)和直接測序技術等。SSCP 可以發現靶DNA片段中未知位置的鹼基突變。Takao經實驗證明小於300bp的DNA片段中 的單鹼基突變，90%可被SSCP發現，他認為現在知道的所有單鹼基改變絕大多數可用該方 法檢測出來。另外，SSCP方法可通過聚丙烯醯胺凝膠電泳將不同迀移率的突變單鏈DNA分 離，並且還可以進一步提純。用這種方法可以最終從DNA序列水平上鑑別突變DNA片段。該 方法簡便、快速、靈敏，不需要特殊的儀器。
[0005] 胰島素是能量代謝中的一種合成代謝激素，在調節糖類平衡方面具有重要作用。 胰島素可以促進葡萄糖轉運。肥胖往往伴隨著胰島素抵抗。胰島素抵抗是在胰島素起作用 的目標組織（例如肝臟、骨骼肌以及脂肪組織）中胰島素作用減弱的一種病理學狀態。胰 島素和胰島素受體（IR)結合，催化細胞內底物如IRS蛋白發生酪氨醯基磷酸化。IRS-1蛋 白在胰島素代謝中具有重要作用。胰島素受體介導的IRS磷酸化激活兩種信號通路來抑制 葡萄糖轉運。PI3K-蛋白激酶B (Protein kinase B，PKB/Akt)信號通路對於控制葡萄糖攝 取的胰島素活性以及抑制葡萄糖異生起重要作用。LYRM1基因是與人類肥胖相關的易感基 因，其編碼的蛋白在N端臨近區域存在一高度保守的三肽基序一一LYR結構域，屬於NADH 複合物元件。LYRM1通過降低PI3K和Akt的磷酸化水平來降低胰島素刺激狀態下的葡萄 糖的攝取。LYRM1基因分布較廣泛，在各種組織中都有發現。肥胖群體的網膜脂肪組織中 LYRM1基因高豐度表達，在骨骼肌中的表達量也很高，研宄表明該基因能夠促進前體脂肪細 胞的分化，並且抑制其細胞編程性死亡，並且可能參與線粒體的功能以及能量代謝。因此， 研宄哺乳動物LYRM1基因遺傳變異和分子遺傳特徵具有重要理論和實踐意義。
[0006] 目前，對於LYRM1基因遺傳變異的研宄較少，著重在小鼠和人類肥胖症上。國內外 關於家畜LYRM1基因遺傳變異的研宄，目前在山羊中還未見相關報導。由於LYRM1基因對於 維持正常體重，胰島素敏感性以及葡萄糖代謝所必需，目前亟需提供一種檢測方法為LYRM1 基因SNP與體尺性狀關係的建立奠定基礎，以便用於山羊生長性狀的標記輔助選擇（MAS)， 快速建立遺傳資源優良的山羊種群。
【發明內容】
[0007] 本發明目的在於提供一種山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法及檢 測試劑盒，以加快良種選育速度和提高種群品質。
[0008] 為達到上述目的，本發明採用了以下技術方案：
[0009] 山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，包括以下步驟：
[0010] ⑴以待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增山羊LYRM1基 因部分序列；
[0011] 所述的引物對P為：
[0012] 上遊引物（SEQ. ID. NO. 1) :5' ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3'
[0013] 下遊引物（SEQ. ID. NO. 2) :5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3'
[0014] (2)對PCR擴增產物進行SSCP檢測：PCR擴增產物經變性劑變性處理後進行聚丙 烯醯胺凝膠電泳，然後根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果結合測序判定多態性位點的基因型， 所述多態性位點為：
[0015] 在山羊的LYRM1基因第8793位為G或T的鹼基多態性位點，表現為GG、GT以及TT 三種基因型。
[0016] 所述的PCR擴增的反應程序為：94°C預變性4min ;94°C變性45s，58°C退火50s， 72°C延伸lmin，32個循環；最後72°C延伸10min，4°C保存。
[0017] 所述聚丙烯醯胺凝膠電泳採用10 %的聚丙烯醯胺凝膠。
[0018] 山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測試劑盒，包括引物對P，所述的引物對 P為：
[0019] 上遊引物（SEQ. ID. NO. 1) :5' ACAGGCTTAGTTGCTCCC 3'
[0020] 下遊引物（SEQ. ID. NO. 2) :5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3'
[0021] 與現有技術相比，本發明提供了一種簡單、快速、低成本、精確度高的山羊LYRM1 基因多態性位點檢測方法，便於推廣應用的在DNA水平上篩查和檢測與山羊生長性狀密切 相關的遺傳標記，可用於山羊的輔助選擇和分子育種，以加快良種選育速度和提高種群品 質。
【專利附圖】
【附圖說明】
[0022] 圖1是引物對P擴增不同山羊個體PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖；
[0023] 圖2是本發明中PCR產物混合測序篩查到的山羊LYRM1基因序列第8793位G-T 突變測序結果圖；
[0024] 圖3是本發明山羊LYRM1基因第8793位多態位點聚丙烯醯胺凝膠電泳圖。
【具體實施方式】
[0025] 下面結合附圖和實施例對本發明做詳細說明，所述是對本發明的解釋而不是限 定。
[0026] 本發明首先根據LYRM1基因的保守序列設計引物，分別以4個山羊群體的基因組 DNA為模板，進行PCR擴增，混合PCR產物並對其純化，測序。然後，進行測序圖分析和序列 比對篩查出SNP位點；其次，對待測群體進行多態位點的PCR-SSCP檢測；最後，根據在群體 中檢測到的基因型，進行群體遺傳統計分析和體尺性狀的關聯分析，篩選出與山羊體尺性 狀密切相關的分子標記。本發明把PCR產物混合測序篩查SNP與PCR-SSCP結合起來解決 了 SSCP的不穩定性，以防突變位點的漏檢。
[0027] (一）、山羊LYRM1基因部分DNA序列的擴增及其多態性的檢測
[0028] 1、山羊樣品的採集及處理
[0029] 本發明採用了 4種山羊品種共計315個個體，具體為：（1)波爾山羊血液樣品72 份，採自江蘇省徐州市豐縣梁寨合作種羊場；（2)徐淮白山羊血液樣品81份，採自江蘇省徐 州市銅山縣呂梁鄉；（3)海門山羊血液樣品116份，採自江蘇省南通海門；（4)波爾山羊X 徐淮白山羊耳組織樣品46份，採自江蘇省徐州市豐縣梁寨合作種羊場。取山羊血樣10mL， 加入0? 5mol/L的EDTA 500 y L抗凝，緩慢顛倒3次後放入冰盒，-80°C保存備用。取耳組織 樣，在70%乙醇保存，冰盒低溫帶回實驗室，-80°C保存備用。
[0030] 2、基因組DNA的提取
[0031] (1)將冷凍血樣室溫解凍，轉移500 y L至1. 5mL Eppendorf管，加入等體積PBS緩 衝液，充分混勾，12000r/min離心10min(4°C )，棄去上清液，重複上述步驟至上清液透明、 沉澱呈淡黃色。
[0032] (2)在離心管中加入DNA抽提緩衝液500 y L，搖動，使血細胞沉澱脫離離心管管 壁，37°C水浴lh。DNA抽提緩衝液的配製：0. 6057g的Tris、18. 612g的EDTA和2. 5g的SDS 加超純水500mL，滅菌、調pH至8. 0,4°C保存備用。
[0033] (3)加蛋白酶K 3yL(20mg/mL)並混勻，55°C過夜至澄清，尚未澄清者，可補加 1 y L蛋白酶K混勻繼續消化至澄清。
[0034] (4)將反應液冷卻至室溫，加Tris-飽和酚500 y L，溫和搖動離心管20min，使其充 分混勻，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另一 1. 5mL離心管中，重複一次。
[0035] (5)加氯仿500 y L，充分混勾20min，4°C，12000r/min離心lOmin，將上清液轉入另 一 1. 5mL離心管中。
[0036] (6)加0. 1倍體積的NaAc緩衝液及2倍體積的冰冷的無水乙醇，混合轉動離心管 直至白色的絮狀沉澱析出，_20°C保存30?60min。
[0037] (7) 4°C，12000r/min離心lOmin，棄上清，用70%的冰冷乙醇漂洗DNA沉澱2次。
[0038] (8)4°C，12000r/min離心10min，棄上清，室溫下使乙醇揮發乾淨。
[0039] (9)乾燥後的DNA溶於80?100 y L的TE-緩衝液或超純水，4°C保存直至DNA完 全溶解，0. 8%瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量，-80°C保存。
[0040] 耳組織DNA的提取參考文獻Sambrock et al (2002)方法。
[0041] 3、擴增引物設計
[0042] 由於GenBank中沒有山羊LYRM1基因序列，所以，本發明以牛（GenBank : NC_007326. 5)序列為參考，利用Primer 5. 0設計能夠擴增包含山羊LYRM1基因第3外顯子 的PCR引物。
[0043] 擴增第3外顯子的引物為：
[0044] 上遊引物：5 'ACAGGCTTAGTTGCTCCC3 '
[0045] 下遊引物：5 'ITCAGTCTTCTGCCCACA3 '
[0046] 以上述引物對擴增了山羊LYRM1基因第3外顯子部分區域及一部分內含子區域。
[0047] 4、PCR 擴增
[0048] 分別以4個山羊品種的DNA為模版，用上述設計的引物對進行PCR擴增，PCR總反 應體系為15 y L，見表1 ;PCR總反應程序，見表2。
[0049] 表1本發明的PCR反應體系
【權利要求】
1. 山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特徵在於：包括以下步驟： (1) 以待測山羊全基因組DNA為模板，以引物對P為引物，PCR擴增山羊LYRM1基因部 分序列； 所述的引物對PS: 上遊引物：5' ACAGGCTTAGITGCTCCC 3' 下遊引物：5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3' (2) 對PCR擴增產物進行SSCP檢測：PCR擴增產物經變性劑變性處理後進行聚丙烯醯 胺凝膠電泳，然後根據聚丙烯醯胺凝膠電泳結果結合測序判定多態性位點的基因型，所述 多態性位點為： 在山羊的LYRM1基因第8793位為G或T的鹼基多態性位點，表現為GG、GT以及TT三 種基因型。
2. 如權利要求1所述的山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特徵在於： 所述的？〇?擴增的反應程序為：94°0預變性4111111;941：變性458,581：退火5〇8,721：延伸 lmin，32個循環；最後72°C延伸lOmin。
3. 如權利要求1所述的山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測方法，其特徵在於： 所述聚丙烯醯胺凝膠電泳採用10%的聚丙烯醯胺凝膠。
4. 山羊LYRM1基因單核苷酸多態性位點的檢測試劑盒，其特徵在於：包括引物對P，所 述的引物對P為： 上遊引物：5' ACAGGCTTAGITGCTCCC 3' 下遊引物：5' ITCAGTCTTCTGCCCACA 3'。
【文檔編號】C12Q1/68GK104450933SQ201410812129
【公開日】2015年3月25日 申請日期:2014年12月22日 優先權日:2014年12月22日
【發明者】房興堂, 陳宏 , 劉宣宣, 張春雷, 金晶, 王豔紅 申請人:江蘇師範大學