禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法
2023-05-25 05:35:46
專利名稱：禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法
技術領域：
本發明涉及的是一種疫苗的製備方法，具體地說，是一種禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法。用於生物工程技術領域。
背景技術：
多殺性巴氏桿菌CVCC458是《中國菌種目錄》在編菌種(英文版，1992年10月機械工業出版社出版，中國微生物菌種保藏管理委員會編著)，中國獸醫微生物保藏中心作為中國微生物菌種保藏管理委員會下設機構保證常年為國內外教學、科研、生產單位提供《中國菌種目錄》中的微生物，列入《中國菌種目錄》的微生物將長期保存，一直對外供應，公眾能從中國獸醫微生物保藏中心買到的微生物菌種(CVCC中國獸醫微生物保藏中心，該中心20多年來為生產、科研、教學提供了6萬多株各類獸醫微生物菌種)。多殺性巴氏桿菌是禽霍亂的病源，能引起感染禽的急性死亡，死亡率可達100％。CVCC458是列入《中國菌種目錄》的微生物，1987年從發病雞中分離，血清型A組。禽霍亂常規的滅活疫苗是採用禽多殺性巴氏桿菌標準株或從自然病死禽分離鑑定的菌株中篩選出毒力強、免疫原性好的毒株，按人工培養方法研製成不同佐劑的滅活疫苗。研究發現活體培養的多殺性巴氏桿菌具交叉保護特性，而以普通培養基培養的多殺性巴氏桿菌則不能產生交叉保護。
經對現有技術的文獻檢索發現，中國專利公開號CN1205897Y，
公開日為1999年1月27日，發明名稱為禽霍亂油乳劑滅活苗及其製備方法，該專利自述為將禽源的多殺性巴氏桿菌接種血瓊脂斜面，37℃培養24小時，檢驗純正，作為種子菌液接種雞胚，回收尿囊液和胚體，經甲醛滅活後製成水相(抗原)再與複方礦物油(10號白油)充分混合製成油包水乳劑。該苗使用後產生抗體的時間長，一般2周以後。
發明內容
本發明的目的在於克服現有技術中的不足，提供一種禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，使其免疫雞後副作用小，免疫產生時間早，免疫力強，免疫期長。
本發明是通過以下技術方案實現的，本發明具體步驟如下1)將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復甦後連續3次傳代接種11日齡雞胚，分離鑑定細菌作菌種；2)將菌種通過禽胚增殖細菌，使培養物的含菌量高達1011CFU/ml以上(CFU為菌落形成單位)，通過活體培養可使巴氏桿菌產生交叉保護因子，提高了抗原質量；3)菌體滅活後，按液體總量(水相)5％加入鹽酸左旋咪唑和按液體總量(水相)20％加入亞硒酸鈉維生素E注射液；4)在高壓乳化泵中將水相與油相按4∶6比例混合乳化，即成禽霍亂強化滅活疫苗，每0.5ml含菌體100億。
本發明的基本原理是，使用禽胚作為菌體的增殖材料，使巴氏桿菌獲得了傳統馬丁肉湯所沒有的而活體中存在的必需因子，一方面使巴氏桿菌生長得更為粗壯，莢膜部分特別肥厚，導致抗原質量的提高；另一方面，細菌在活體中生長，能產生所有血清型的保護性免疫原，從而產生交叉免疫力。左旋咪唑和硒在免疫調節上有重要作用，能提高免疫原的抗體效價。在本苗中同時加入左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E，通過提高機體的細胞免疫功能，激活輔助性T細胞，產生B細胞活化因子，協助B細胞產生抗體，依靠細胞免疫和體液免疫，使機體在免疫早期產生高滴度抗體。
本發明的有益效果是強化滅活苗免疫雞後7天產生堅強免疫力，免疫期6個月，免疫期內攻毒保護率94.4％～97.6％。特別是在發病雞場，可用本苗進行緊急接種。本苗適用於各養禽場，安全可靠。
具體實施例方式
實施例1將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復甦後連續3次傳代接種11日齡雞胚，分離鑑定細菌作菌種；將菌種回歸雞2次，分離細菌接種於改良BPY培養基18小時，鏡檢無雜菌後作為種子液，行尿囊腔接種11日齡雞胚，孵化30小時，收穫雞胚、尿囊液和少量卵黃囊，組織搗碎機搗碎，對倍加入含有0.5％福馬林的滅菌生理鹽水，搖勻後滅活18小時。在菌體滅活前，按部頒標準進行培養物細菌總數測定，含菌量一般為1011CFU/ml以上。取滅活菌液接種於鮮血培養基培養48小時，無細菌生長時備用。在滅菌液中加入無菌4％吐溫-80，按5％加入無菌鹽酸左旋咪唑，20％加入亞硒酸鈉維生素E注射液，調pH7.0為水相；在10號白油中加入6％司本-80，再加入2％硬脂酸鋁，滅菌後為油相。在高壓乳化泵中將水相與油相按4∶6比例混合乳化，即成禽霍亂強化滅活疫苗，每0.5ml含菌體100億。
該苗經性狀測定和安全性試驗表明，為油包水類型，穩定性良好，粘度適中，安全可靠。疫苗在20℃保存3個月，4℃保存9個月不出現分層。試驗雞接種本苗後4天產生免疫應答，7天產生堅強的免疫力，免疫期6個月，免疫期內的攻毒保護率為94.4％～97.6％。
實施例2將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復甦後連續3次傳代接種11日齡雞胚，分離鑑定細菌作菌種；將菌種回歸雞2次，分離細菌接種於改良BPY培養基18小時，鏡檢無雜菌後作為種子液，行尿囊腔接種14日齡鴨胚，以後製備過程同實施例1。
強化滅活疫苗免疫雞後7天產生堅強免疫力，免疫期6個月，免疫期內攻毒保護率94.4％～97.6％。特別是發病雞場可用本苗進行緊急接種，克服了弱毒苗發病後和用藥後不能使用的缺點。
權利要求
1.一種禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，其特徵在於，具體步驟如下1)將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復甦後連續傳代接種雞胚，分離鑑定細菌作菌種；2)將菌種通過禽胚增殖細菌，使培養物的含菌量高達1011CFU/ml以上；3)菌體滅活後，在水相中加入鹽酸左旋咪唑和亞硒酸鈉維生素E注射液；4)在高壓乳化泵中將水相與油相按比例混合乳化，即成禽霍亂強化滅活疫苗。
2.根據權利要求1所述的禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，其特徵是，所述的多殺性巴氏桿菌CVCC458復甦後連續3次傳代接種11日齡雞胚。
3.根據權利要求1所述的禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，其特徵是，所述的鹽酸左旋咪唑的濃度是按水相5％，亞硒酸鈉維生素E注射液的濃度是按水相20％。
4.根據權利要求1所述的禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，其特徵是，所述的水相與油相的比例為4∶6。
5.根據權利要求1所述的禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，其特徵是，所述的禽霍亂強化滅活疫苗，每0.5ml含菌體100億。
全文摘要
一種用於生物工程技術領域的禽霍亂強化滅活疫苗的製備方法，本發明步驟為1)將禽多殺性巴氏桿菌CVCC458復甦後連續傳代接種雞胚，分離鑑定細菌作菌種；2)將菌種通過禽胚增殖細菌，使培養物的含菌量高達10
文檔編號A61P31/00GK1724068SQ20051002733
公開日2006年1月25日 申請日期2005年6月30日 優先權日2005年6月30日
發明者劉永德, 葉陳梁, 吳祖立, 嚴亞賢 申請人:上海交通大學