一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法和應用的製作方法

2023-05-24 04:55:46 1

一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法和應用的製作方法
【專利摘要】本發明涉及一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法和應用，其基因工程菌的構建方法主要將油桐油酸脫氫酶基因vfFAD2基因和二醯甘油醯基轉移酶vfDGAT2構建融合表達載體導入粘紅酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘紅酵母體內獲得高效表達。與未轉基因粘紅酵母相比，本發明的轉基因粘紅酵母轉化子油脂含量提高2.76倍，亞油酸含量提高25.86%。
【專利說明】一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法和應用
【技術領域】
[0001]本發明屬於生物工程領域。具體的說，本發明涉及一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法。
【背景技術】
[0002]粘紅酵母(Rhodotorulaglutinis (Fres.) Harrison)是一種重要的工業菌株，可以生產微生物油脂和其他活性物質，包括類胡蘿蔔素、L-苯丙氨酸、過氧化物歧化酶，近年來日益受到營養學家和藥理學家的重視。
[0003]目前對於產油粘紅酵母基因工程改良的報導不多，特別是以提高亞油酸含量為目的，並且同時提高含油量的基因工程改良還未有報導，而亞油酸是人體的必需胺基酸，因此提高粘紅酵母油脂含量特別是亞油酸的含量有重要意義。

【發明內容】

[0004]本發明的目的在於提供一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法，以提高粘紅酵母油脂及亞油酸的含量。
[0005]本發明的技術方案還在於採用了一種粘紅酵母油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法，將油桐油酸脫氫酶基因 vfFAD2基因和二醯甘油醯基轉移酶vfDGAT2構建融合表達載體導入粘紅酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘紅酵母體內獲得高效表達，其基因工程菌構建的具體步驟如下:
[0006](I)採用同源序列克隆方法，以油桐基因組DNA為模板進行PCR擴增，擴增得到的產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收純化，進行TA克隆，並測序，獲得目的基因 vfFAD2，vfDGAT2 ；
[0007](2)利用耦聯小肽將目的基因vfFAD2與vfDGAT2耦聯；
[0008](3)將vfFAD2-vfDGAT2與表達載體pCAMBIA1301重組，獲得重組載體pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2, PCR驗證、酶切、測序驗證重組載體；
[0009](4)利用農桿菌介導法，重組表達載體pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2轉化粘紅酵母，將微孔濾膜轉移到含60 μ g.mL-1鏈黴素,200 μ g.mL_l頭孢黴素和100 μ g.mL_l卡那黴素的SM I篩選培養基中，培養3-5d後，將初篩得到的轉化子與野生型粘紅酵母同時在含300 μ g.mL-1頭孢黴素，150 μ g.mL-1卡那黴素的SM II平板上劃線，培養3_5d後，能正常生長的初步認定為陽性轉化子；
[0010](5)提取基因組DNA、PCR驗證獲得陽性轉化子。
[0011]本發明的技術方案還採用了一種粘紅酵母轉化子的篩選方法，首先用60 μ g.mL-1鏈黴素，200 μ g.mL-1頭孢黴素和100 μ g.mL-1卡那黴素的SM I篩選培養基培養3-5d後，再將初篩得到的轉化子與野生型粘紅酵母同時在含300 μ g.mL-1頭孢黴素，150 μ g.mL-1卡那黴素的SM II平板上劃線篩選，最後提取基因組DNA，進行PCR驗證。[0012]本發明的技術方案還採用了一種粘紅酵母的培養方法，具體步驟如下:將粘紅酵母保藏斜面轉接到PDA培養基上，28°C培養48h之後，挑2環接入裝有50mL液體種子培養基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養24h，然後按1:10的接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，於28°C振蕩發酵72h，發酵結束經離心收集菌體；種子培養基:15g.L-1葡萄糖，Ig.L—1 酵母粉,2g.L—1 (NH4)2SO4, 7g.L-1KH2PO4, 2g.L-1Na2HPO4,1.5g.L^1MgSO4,PH5.5 ;發酵培養基:50g.L—1 葡萄糖，Ig.L—1 酵母粉，2.5g.T1(NH4)2SO4Jg.L^1KH2PO4,2g.L-1Na2HPO4, 2g.L-1MgSO4,0.1g.L^1CaCl2j0.07g.L-1FeCl3, PH5.5。[0013]本發明的目的還在於提供了一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產微生物油脂方面的應用。
[0014]本發明的目的還在於提供了一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在生產功能性油脂方面的應用。
[0015]本發明的目的還在於提供了一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorula glutinis)在食品方面的應用。
[0016]說明書附圖:
[0017]圖1.vfFAD2, vfDGAT2 基因的獲得；
[0018]圖2.重組質粒 pCAMBIA1301-FAD2-2A-DGAT2 的 PCR 驗證，I:FAD2 ；2:DGAT2 ；3:FAD2+2A+DGAT2 ；4:空載對照；5:DNA Marker ；
[0019]圖3.FAD2/DGAT2轉化子的抗生素篩選及PCR驗證。a:SM I平板篩選；b:SM II平板篩選；c:使用 FAD2-F/R 引物；d:使用 DGAT2-F/R 引物；M:DNA marker2000 ;1_3:FAD2/DGAT2酵母轉化子；4:野生型酵母；
[0020]圖4.共表達酵母中FAD2與DGAT2基因的表達分析。a:FAD2基因的表達；d:DGAT2基因的表達；
[0021]圖5.FAD2/DGAT2共表達酵母的脂肪酸組成分析。
【具體實施方式】
[0022]實施例1、FAD2-DGAT2重組表達載體的構建
[0023](I)基因的獲得
[0024]根據NCBI上已提交的油桐vfFAD2序列(Genbank登錄號:AF525534)，利用分子生物學分析軟體01igo6.0設計引物:
[0025]VF2a:5』 TATCTTCAGGTTGGGCAACGA3』 ；
[0026]VF2b:5』 CGATTGAACGGCCTACATTAT3』。
[0027]DGAT2-F:5』 -CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3』
[0028]DGAT2-R:5』 -TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3』
[0029]PCR 反應程序:94°C預變性 3min，94°C變性 45s，60°C退火 45s，72°C延伸 lmin，共35個循環，最後72°C延伸IOmin。1%瓊脂糖電泳結果如圖1。
[0030]目的片段回收及與pMD18_T simple vector連接:
[0031]將PCR擴增得到的vfFAD2目的片段進行凝膠回收，回收產物與pMD18_T simplevector 連接:
【權利要求】
1.一種粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法，其特徵在於，將油桐油酸脫氫酶基因vfFAD2基因和二醯甘油醯基轉移酶vfDGAT2構建融合表達載體導入粘紅酵母，使vfFAD2基因和vfDGAT2基因在粘紅酵母體內獲得高效表達，其基因工程菌構建的具體步驟如下: (1)粘紅酵母進行活化和培養； (2)利用同源克隆法，根據GenBank上已知序列，以油桐基因組DNA為模板，進行PCR擴增，擴增得到的產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠回收試劑盒回收純化，進行TA克隆，並測序，獲得目的基因vfFAD2，vfDGAT2 ； (3)利用耦聯小肽，將vfFAD2與vfDGAT2耦聯，再與表達載體pCAMBIA1301重組，獲得重組載體pCAMBIA1301-vfFAD2- vfDGAT2，酶切、測序驗證重組載體； (4)利用農桿菌介導法，重組載體pCAMBIA1301-vfFAD2-vfDGAT2轉化粘紅酵母，將微孔濾膜轉移到含60 μ g*mL-l鏈黴素，200 μ g*mL-l頭孢黴素和100 μ g*mL-l卡那黴素的SM I篩選培養基中，培養3-5 d後，將初篩得到的轉化子與野生型粘紅酵母同時在含300μ g*mL-l頭孢黴素，150 μ g*mL-l卡那黴素的SM II平板上劃線，培養3_5 d後，能正常生長的初步認定為陽性轉化子；提取基因組DNA、PCR驗證獲得陽性轉化子； (5)氣相色譜法檢測結果表明，與未轉基因粘紅酵母相比，轉基因粘紅酵母轉化子油脂含量提高2.76倍，亞油酸含量提高25.86%。
2.根據權利要求1所述的粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌的構建方法，其特徵在於，步驟(2)中擴增引物為:
FAD2-Y:5』 -TGTCCTCCGTTCATTCTCAT-3』 ；`
FAD2-R:5， -GCAAGACGGTAGAGACCAAA-3，
DGA T2-V: 5，-CTTTCGTTCTGATCGTGCTT-3，
DGA T2-R: 5，-TAGGCTGTGGATTTTGCTTCG-3， PCR反應程序為:94 °C預變性5 min ；94 °C變性30 S，58 °C退火40 S，72 °C延伸50S，35個循環；72 °C延伸10 min ;PCR擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。
3.根據權利要求1所述的粘紅酵母生產高亞油酸含量的基因工程菌的構建方法，其特徵在於，步驟(4) 60 μ g*mL-l鏈黴素，200 μ g*mL_l頭孢黴素和100 μ g*mL_l卡那黴素的SM I篩選培養基中培養3-5 d後，將初篩得到的轉化子與野生型粘紅酵母同時在含300μ g*mL-l頭孢黴素，150 μ g*mL-l卡那黴素的SM II平板上劃線篩選初步獲得陽性轉化子，提取基因組DNA，進行PCR驗證進一步鑑定陽性轉化子。
4.一種粘紅酵母的培養方法，其特徵在於，將粘紅酵母保藏斜面轉接到PDA培養基上，28°C培養48h之後，挑2環接入裝有50mL液體種子培養基的250mL三角瓶中，28°C振蕩培養24h，然後按1:10的接種量接入裝有50mL發酵培養基的250mL三角瓶中，於28°C振蕩發酵72 h，發酵結束經離心收集菌體；種子培養基:15 g.!/1葡萄糖，I g.!/1酵母粉，2g*L^ (NH4)2SO4, 7 g.171 KH2PO4, 2 g*L^1Na2HPO4,1.5 g.171 MgSO4, PH 5.5 ;發酵培養基:50g.L—1 葡萄糖，1 8噸_1酵母粉,2.5 g.L—1 (NH4)2SO4, 7 g.L—1 KH2PO4, 2 g.L—1 Na2HPO4, 2 g.L—1MgSO4,0.1 g.1^CaCly0.07 g.L-1FeCl3，PH 5.5。
5.一種如權利要求1所述的粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產微生物油脂方面的應用。
6.一種如權利要求1所述的粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在生產功能性油脂方面的應用。
7.一種如權利要求1所述的粘紅酵母高產油脂及亞油酸基因工程菌(Rhodotorulaglutinis)在食品方面的 應用。
【文檔編號】C12N15/81GK103509817SQ201310421519
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2013年9月16日 優先權日:2013年9月16日
【發明者】汪陽東, 陳益存 申請人:中國林業科學研究院亞熱帶林業研究所