修飾的腦膜炎球菌fHBP多肽的製作方法

2023-05-25 01:36:31

專利名稱：修飾的腦膜炎球菌fHBP多肽的製作方法
技術領域：
本發明屬於免疫領域，具體地說，是針對奈瑟球菌屬，如腦膜炎奈瑟球菌致病菌導致疾病的免疫。
背景技術：
腦膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)是一種革蘭陰性莢膜菌,寄居在大約10%人群上呼吸道中。雖然已有針對A、C、W135和Y血清群的多糖和偶聯疫苗，但疫苗不能應用於血清群B，因為其莢膜多糖是一種多聚唾液酸的聚合物，是人類的一種自身抗原。為了開發針對血清群B的疫苗，已採用了外膜囊泡(OMV)包含的表面暴露蛋白。這些疫苗 能誘導產生血清殺菌抗體應答和抵抗疾病，但不能誘導菌株間交叉保護作用[I]。因此，一些研究人員專注於可用於疫苗的特異性腦膜炎球菌抗原[2]。一種這樣的抗原是腦膜炎H因子結合蛋白(fHBP)，也稱作蛋白『741』 [文獻3中的 SEQ IDs 2535 & 2536 ;本文的 SEQ ID I], 『NMB1870』，『GNA1870』 [文獻 4-6，以下文獻2]，『P2086』，『LP2086』或『0RF2086』 [7-9] 0這種脂蛋白在所有腦膜炎球菌血清群中都有表達，見於多種腦膜炎球菌株，已將fHBP序列分為三個家族[4](在本文中稱為家族I、II和III)，已發現產生的對某給定家族血清對同一家族有殺細菌活性，但對表達其它兩個家族之一的菌株無活性，即具有家族內、而非家族間交叉保護作用。

發明內容
使fHBP結合fH的能力與其免疫原性解離可產生改良的抗原。例如，fHBP表面上的重要表位可能在體內結合fH後被隱藏躲開了免疫系統。相反，宿主蛋白與疫苗組分的高親和性結合在一些對象中可能導致意想不到的疫苗接種後果。因此，本發明的一個目的是提供經過修飾結合fH能力比野生型fHBP減弱但保留了誘導殺菌性抗fHBP抗體能力的fHBP。文獻10已經鑑定了 fHBP/fH相互作用中的幾個重要殘基。例如，野生型的兩個穀氨酸殘基突變使該蛋白對fH的親和力降低了兩個數量級。然而，文獻10沒有公開這些改變對fHBP免疫原性的影響。然而如本文所示，表達這二個Glu突變的細菌對野生型fHBP誘導的殺菌性抗體敏感。因此，有可能使fHBP的H因子結合活性與其殺菌敏感性解離。菌株MC58的全長fHBP胺基酸序列(SEQ ID NO 1)如下MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKGLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQVYKQSHSALTAFQTEQIQDSEHSGKMVAKRQFRI⑶IAGEHTSFDKLPEGGRATYRGTAFGSDDAGGKLTYTIDFAAKQGNGKIEHLKSPELNVDLAAADIKPDGKRHAVISGSVLYNQAEKGSYSLGIFGGKAQEVAGSAEVKTVNGIRHIGLAAKQ
該序列是fHBP家族I的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO :1前19個胺基酸(SEQ ID NO :4)，而fHBP的AG形式缺少前26個胺基酸(SEQ ID NO 7)菌株2996的全長fHBP胺基酸序列(SEQ ID NO 2)如下 MNRTAFCCLSLTAALILTACSSGGGGVAADIGAGLADALTAPLDHKDKSLQSLTLDQSVRKNEKLKLAAQGAEKTYGNGDSLNTGKLKNDKVSRFDFIRQIEVDGQLITLESGEFQIYKQDHSAVVALQIEKINNPDKIDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPDGKAEYHGKAFSSDDAGGKLTYTIDFAAKQGHGKIEHLKTPEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ該序列是fHBP家族II的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO :1前19個胺基酸(SEQ ID NO :5)，而fHBP的AG形式缺少前26個胺基酸(SEQ ID NO 8)。菌株M1239的全長fHBP胺基酸序列(SEQ ID NO 3)如下
MNRTAFCCLSLTTALILTACSSGGGGSGGGGVAADIGTGLADALTAPLDHKDKGLKSLTLEDSIPQNGTLTLSAQGAEKTFKA⑶KDNSLNTGKLKNDKISRFDFVQKIEVDGQTITLASGEFQIYKQNHSAVVALQIEKINNPDKTDSLINQRSFLVSGLGGEHTAFNQLPGGKAEYHGKAFSSDDPNGRLHYSIDFTKKQGYGRIEHLKTLEQNVELAAAELKADEKSHAVILGDTRYGSEEKGTYHLALFGDRAQEIAGSATVKIGEKVHEIGIAGKQ該序列是fHBP家族III的序列。此成熟的脂蛋白缺少SEQ ID NO :1前19個胺基酸(SEQ ID NO :6)，而fHBP的AG形式缺少前31個胺基酸(SEQ ID NO 9)。NMR研究鑑定了參與fHBP/fH相互作用的各個胺基酸殘基。因此，可修飾SEQ IDNO :4、5和6各自中以下編號的一個或多個殘基，以抑制fH/fHBP相互作用
權利要求
1.一種多肽，其特徵在於，包含(a)與SEQID NO :4，5或6任一序列至少90%相同的胺基酸序列和/或包含SEQ ID NO :4，5或6的片段；但(b)其中以下所示SEQ ID NO :4、5或6序列的一個或多個胺基酸殘基缺失或被不同胺基酸取代
2.如權利要求I所述的多肽，其特徵在於，包含與SEQID NO 4具有至少90%相同的胺基酸序列，和/或包含SEQ ID NO :4的片段，和給予宿主動物後可引發能識別含SEQ IDNO 4序列的野生型腦膜炎多肽的抗體。
3.一種設計修飾的fHBP胺基酸序列的方法，其特徵在於，包括步驟(i)提供起始胺基酸序列，其中含有該起始胺基酸序列或由其組成的蛋白能結合人H因子；(ii)採用配對序列比對算法鑑定該起始胺基酸序列內與權利要求I表格中所列SEQ ID NO :4、5或6的殘基相對的胺基酸殘基；(iii)刪除步驟(ii)所述鑑定的胺基酸或用不同的胺基酸置換，從而提供修飾的fHBP胺基酸序列。
4.一種多肽，其特徵在於，包含(i)用權利要求3所述方法設計的修飾的fHBP胺基酸序列，或( )選自SEQ ID NO :23-32序列的胺基酸序列。
5.一種核酸，其特徵在於，編碼權利要求I、權利要求2或權利要求4所述的多肽。
6.一種包含編碼權利要求1、2或4任一項所述多肽的核苷酸序列的質粒。
7.一種用權利要求6所述的質粒轉化的宿主細胞。
8.如權利要求7所述的宿主細胞，其特徵在於，所述細胞是腦膜炎球菌。
9.權利要求8所述宿主細胞製備的膜囊泡，其特徵在於，所述囊泡包含權利要求1、2或4任一項所述的多肽。
10.一種免疫原性組合物，其特徵在於，包含權利要求1、2或4所述的多肽，或權利要求9所述的囊泡。
11.如權利要求10所述的組合物，其特徵在於，包括佐劑。
12.如權利要求11所述的組合物，其特徵在於，所述佐劑包括鋁鹽。
13.如權利要求10-12任何一項所述的組合物，其特徵在於，還包含第二多肽，在給予哺乳動物時，可引發對腦膜炎球菌的殺菌抗體應答反應，限制條件是所述第二多肽不是腦膜炎球菌的fHBP。
14.如權利要求10-13任何一項所述的組合物，其特徵在於，還包含腦膜炎奈瑟球菌血清群A、C、W135和/或Y的偶聯莢膜糖。
15.如權利要求10-14任何一項所述的組合物，其特徵在於，還包含偶聯的肺炎球菌莢月旲糖。
16.一種引發哺乳動物抗體應答的方法，其特徵在於，包括給予權利要求10-15任何一所述的免疫原性組合物。
全文摘要
可使腦膜炎球菌fHBP的H因子結合活性與其殺菌敏感性分開。NMR研究鑑定了參與fHBP/H相互作用的多個胺基酸殘基，修飾fHBP中這些殘基的一個或多個可降低或消除其結合fH的能力。
文檔編號C07K14/22GK102917730SQ201080060450
公開日2013年2月6日 申請日期2010年10月27日 優先權日2009年10月27日
發明者L·班西, F·坎蒂尼, S·德拉戈內蒂, M·A·簡蒂萊, D·維吉, M·斯卡塞利, M·皮薩 申請人:諾華有限公司