一種快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法與流程
2023-05-03 21:06:01 2
本發明屬於林木生物技術領域，涉及一種植物培育方法，具體涉及一種快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法。
背景技術：
黑果枸杞(lyciumruthenicummurr)，為茄科(solanceae)枸杞屬多年生多棘刺灌木植物，是重要的抗旱、抗鹽鹼沙漠先鋒樹種之一，其在我國西藏、寧夏賀蘭山、青海東部、陝西北部、新疆北部、內嶺、河床沙灘等條件相當惡劣的環境中皆有零星分布。
野生黑枸杞味甘、性平，富含蛋白質、脂肪、糖類、游離胺基酸、有機酸、礦物質、微量元素、生物鹼、維生素c、b1、b2、鈣、鎂、銅、鋅、錳、鐵、鉛、鎳、鎘、鈷、鉻、鉀、鈉等各種營養成分。經科學檢測，黑果枸杞中的鈣、鐵、尼克酸含量分別為紅果枸杞的2.3、4.6、16.7倍，尤其是原花青素(opc)含量甚至超過藍莓(黑果枸杞含opc3690mg/100g；藍莓含opc330～3380mg/100g)，是迄今為止發現opc含量最高的天然野生果實，也是最有效的天然抗氧化劑，其功效是vc的20倍、ve的50倍，具有超強的增強免疫力、延緩衰老的滋補作用。黑果枸杞中的維生素、礦物質等營養成分含量也很豐富，尤其含具有清除自由基、抗氧化功能的天然的花色甙素，藥用，保健價值遠遠高於普通紅枸杞，被譽為「軟黃金」。
黑果枸杞集經濟價值、生態價值、藥用價值及保健價值於一身，其價格一直居高不下。近年來，農牧瘋狂採摘讓一些野生黑果枸杞不再掛果。如何充分合理的開發利用黑果枸杞資源，是亟需關注的重要課題。目前黑果枸杞苗木市場仍以種苗為主，但種苗價格較高，且很難完全保持親本的優良性狀。
植物的組織培養是根據植物細胞全能性理論於近幾十年來發展起來的一項無性繁殖的新技術。因植物組織培養具有佔用空間小、不受地區和季節限制、培養周期短、可短時間大量繁殖、不存在變異、可保持母本的一切遺傳特徵以及投資少、經濟效益高等優勢，使得該技術一經問世，便迅速在花卉、農作物和林木種苗生產中得到廣泛應用。因此，藉助植物的組織培養技術，建立黑果枸杞再生苗的培育方法，以規模化生產黑果枸杞種苗，從而滿足黑果枸杞的優質豐產和產業化需要。
例如：中國專利文獻cn105850733a公開了一種黑果枸杞再生苗培育方法，其直接通過黑果枸杞的葉片獲得不定芽或者通過黑果枸杞的莖段獲得叢生芽，由於該方法需要首先得到黑果枸杞的葉片或不定芽，因此組培時間久，且芽形成率不高。又如中國專利文獻cn105815221a公開了一種以幼種苗作為外植體供體的黑果枸杞離體快速繁殖方法，其通過無菌種苗的獲得、外植體(種苗的葉片或莖段)接種、繼代增殖及煉苗移栽等完成，該方法實質亦是通過黑果枸杞的葉片或莖段獲得叢生芽，在此過程中需要等待種苗長到葉片數為10～20時方可進行外植體的接種，且當利用種苗葉片為外植體接種一個月時的芽形成率為87.5％。由此可見，現有的黑果枸杞再生苗培育方法普遍存在組培時間長，且芽形成率不高的缺陷。
技術實現要素：
因此，本發明要解決的技術問題在於克服現有技術中獲得黑果枸杞再生苗的培育時間長及通過外植體獲得的芽形成率不高的缺陷，從而提供一種快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法。
為解決上述技術問題，本發明採用的技術方案具體如下：
一種快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，該方法是直接由黑果枸杞的無菌種苗獲得愈傷組織，再經組織培養培育得到黑果枸杞再生苗，其包括如下步驟：
(1)種子的消毒
選取黑果枸杞種子，依次經消毒劑消毒及無菌水衝洗後備用；
(2)無菌種苗的獲得
將步驟(1)的種子置於ms-0培養基中，待所述種子萌發8～12天後得到無菌種苗；
所述ms-0培養基是通過向每升ms培養基中添加30g蔗糖和8.0g瓊脂而得，所述ms-0培養基的ph值為5.0～5.5；
(3)愈傷組織的誘導
將步驟(2)的無菌種苗移栽至ms-1培養基中以誘導形成愈傷組織，培養條件為：溫度23～27℃、光照12h/d、培養基ph值為5.0～5.5，培養35～45天；
所述ms-1培養基是通過向每升ms培養基中添加0.5～1.0mgnaa、1.5～2.5mg6-ba、30g蔗糖及8.0g瓊脂而得；
(4)不定芽的獲得
將步驟(3)的愈傷組織從外植體上剝離下來後置於ms-2培養基中以誘導分化不定芽，培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養基ph值為5.0～5.5，增殖培養3～5代；
所述ms-2培養基是通過向每升ms培養基中添加0.5～1.0mgnaa、0.5～1.4mg6-ba、30g蔗糖及6.0g瓊脂而得；
(5)根的誘導
將步驟(4)的不定芽移栽到所述ms-0培養基中以誘導生根，即得黑果枸杞再生苗；
培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養時間17～22天。
優選的是，步驟(1)中的消毒環節為，先用70v％的酒精浸泡3～7min，再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒10～20min。
更優選的是，所述氯化汞溶液消毒的時間為15min。
優選的是，所述ms培養基的配製方法包括，將ms微量元素母液、ms肌醇母液、ms鐵鹽母液分別稀釋100倍後與稀釋了40倍的ms大量元素母液混合；
所述ms微量元素母液、ms肌醇母液、ms鐵鹽母液、ms大量元素母液的體積之比為5:5:5:2；
所述ms大量元素母液的組成為，每升無菌水中含kno376.0g、nh4no366.0g、mgso4·7h2o14.8g、cacl2·2h2o17.6g、無水cacl213.28g；
所述ms微量元素母液的組成為，每升無菌水中含mnso4·h2o2.23g、znso4·7h2o0.86g、h3bo30.62g、ki0.083g、na2moo4·2h2o0.025g、cuso4·5h2o0.0025g、cocl2·6h2o0.0025g；
所述ms肌醇母液的組成為，每升無菌水中含肌醇10.0g、煙酸0.1g、vitb11.0g、vitb60.1g；
所述ms鐵鹽母液的組成為，feso4·7h2o2.78g、na2edta3.73g。
優選的是，所述ms-0培養基、ms-1培養基、ms-2培養基的ph值均為5.2。
優選的是，每升所述ms-1培養基中含naa1.0mg、6-ba2.0mg。
優選的是，每升所述ms-2培養基中含naa1.0mg、6-ba1.0mg。
優選的是，所述的一種快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，還包括，將步驟(5)得到的生根苗轉入大棚內煉苗至少2周的步驟。
本發明中的v％表示體積百分含量，wt％表示質量百分含量。
本發明的技術方案，具有如下優點：
(1)本發明提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，直接由黑果枸杞的無菌種苗獲得愈傷組織，再經組織培養培育黑果枸杞再生苗，本發明的方法減少了無菌苗的生長環節，與傳統通過種苗的葉片或莖段誘導愈傷組織相比，本發明能大大縮短組培的時間，極大地減少了黑果枸杞的培育成本，同時還有效提高了培育效率，再生苗的移栽成活率高達98％。
(2)本發明提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，通過向每升ms培養基中添加0.5～1.0mgnaa和1.5～2.5mg6-ba，更易於獲得分化的愈傷組織，且愈傷生成率高達到94％。
(3)本發明提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，通過向每升ms培養基中添加0.5～1.0mgnaa和0.5～1.4mg6-ba，有利於不定芽的分化，可快速萌芽，且出芽率達到92％以上。
(4)本發明提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，在誘導生根時不添加任何激素亦可保證生根率高達97％，且根的生長速度較快，每株小苗至少長出3條根，且根系粗壯、根毛繁密。
(5)本發明提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法，種子的消毒採用0.1wt％的氯化汞溶液消毒15min，消毒效果很好，且汙染率和死亡率都非常低，分別為6.5％和8.5％。
(6)本發明提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法所培育的黑果枸杞具有遺傳穩定性好、成本低廉、育苗周期短、繁殖係數高、操作簡便的特點。
附圖說明
為了更清楚地說明本發明具體實施方式或現有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發明的一些實施方式，對於本領域普通技術人員來講，在不付出創造性勞動的前提下，還可以根據這些附圖獲得其他的附圖。
圖1是根據本發明實施例1提供的快速獲得黑果枸杞再生苗的培育方法得到的黑果枸杞植株再生體系的生長狀態示意圖，其中，a:無菌苗種植1周左右，愈傷組織生長情況；b:無菌苗種植2周左右，愈傷組織生長情況；c:無菌苗種植3周左右，愈傷組織生長情況；d:愈傷剝離後，愈傷組織生長約20天；e:愈傷剝離後，愈傷組織生長約30天；f:愈傷剝離後，愈傷組織生長約40天；g:愈傷組織上出現多個分化小芽；h:愈傷組織上繼續生長的分化幼苗；i:開始生根培養的黑枸杞小苗。
具體實施方式
下面將對本發明的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例是本發明一部分實施例，而不是全部的實施例。基於本發明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬於本發明保護的範圍。此外，下面所描述的本發明不同實施方式中所涉及的技術特徵只要彼此之間未構成衝突就可以相互結合。
實驗例1：ms培養基配置
s1：ms培養基母液配置
對照表1-4，分別稱取各組分。
表1：ms大量元素母液配方
稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解後混合，最後定容到1l。
表2：ms微量元素母液配方
稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解後混合，最後定容到1l。
表3：ms肌醇母液配方
稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解後混合，最後定容到1l。
表4：ms鐵鹽母液配方
稱量完畢後，分別用少量的蒸餾水徹底溶解後混合，最後定容到1l。
s2：ms培養基配置
將s1中的ms微量元素母液、ms肌醇母液、ms鐵鹽母液分別稀釋100倍後與稀釋了40倍的ms大量元素母液按等比例混合。
實驗例2：激素naa及6-ba的配置
稱取0.04gnaa粉末，先用1ml無水乙醇溶解，再定容於200ml即得到0.2mg/ml的naa溶液，後保存於4℃冰箱備用。
稱取0.04g6-ba粉末，先用1mol/l稀氫氧化鈉溶液溶解，再定容於200ml即得到0.2mg/ml的6-ba溶液，後保存於4℃冰箱備用。
實施例1
1.種子的消毒
選取黑果枸杞種子，用70v％的酒精浸泡5min後再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒15min，然後用無菌水衝洗3遍。
2.無菌種苗的獲得
向每升ms培養基中添加30g蔗糖和8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.8，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.2。
將步驟1的種子置於ms-0培養基中，待所述種子萌發8～12天後得到無菌種苗。
3.愈傷組織的誘導
向每升ms培養基中添加1.0mgnaa、2.0mg6-ba、30g蔗糖及8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.8，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.2。
將步驟2的無菌種苗移栽至ms-1培養基中以誘導形成愈傷組織，經測定，愈傷生成率為94％。請參見圖1中的圖a～c。培養條件為：溫度23～27℃、光照12h/d、培養基ph值為5.2，培養35～45天。
4.不定芽的獲得
向每升ms培養基中添加1.0mgnaa、1.0mg6-ba、30g蔗糖及6.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.8，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-2培養基，此時培養基的ph值為5.2。
將步驟3的愈傷組織從外植體上剝離下來後置於ms-2培養基中以誘導分化不定芽，經測定，幼芽生成率為95％。請參見圖1中的圖d～h，培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養基ph值為5.2，增殖培養3～5代。
5.根的誘導
將步驟4的不定芽移栽到ms-0培養基中以誘導生根，請參見圖1中的圖i，經測定，生根率為97％。其中：培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養時間17～22天。
6.煉苗移栽
將步驟5得到的生根苗轉入大棚內煉苗2周後，採用環境條件逐漸過渡的方法進行移栽。經測定，移栽成活率為98％。
實施例2
1.種子的消毒
選取黑果枸杞種子，用70v％的酒精浸泡7min後再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒10min，然後用無菌水衝洗3遍。
2.無菌種苗的獲得
向每升ms培養基中添加30g蔗糖和8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.6，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.0。
將步驟1的種子置於ms-0培養基中，待所述種子萌發8～12天後得到無菌種苗。
3.愈傷組織的誘導
向每升ms培養基中添加0.5mgnaa、2.5mg6-ba、30g蔗糖及8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.6，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.0。
將步驟2的無菌種苗移栽至ms-1培養基中以誘導形成愈傷組織，經測定，愈傷生成率為91％。培養條件為：溫度23～27℃、光照12h/d、培養基ph值為5.2，培養35～45天。
4.不定芽的獲得
向每升ms培養基中添加0.5mgnaa、1.4mg6-ba、30g蔗糖及6.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.6，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-2培養基，此時培養基的ph值為5.0。
將步驟3的愈傷組織從外植體上剝離下來後置於ms-2培養基中以誘導分化不定芽，經測定，幼芽生成率為94％。培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養基ph值為5.0，增殖培養3～5代。
5.根的誘導
將步驟4的不定芽移栽到ms-0培養基中以誘導生根，經測定，生根率為96％。其中：培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養時間17～22天。
6.煉苗移栽
將生根苗轉入大棚內煉苗2周後，採用環境條件逐漸過渡的方法進行移栽。經測定，移栽成活率為94％。
實施例3
1.種子的消毒
選取黑果枸杞種子，用體積分數為70％的酒精浸泡3min後再用體積分數為0.1％的氯化汞溶液消毒20min，然後用無菌水衝洗3遍。
2.無菌種苗的獲得
向每升ms培養基中添加30g蔗糖和8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至6.1，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.5。
將步驟1的種子置於ms-0培養基中，待所述種子萌發8～12天後得到無菌種苗。
3.愈傷組織的誘導
向每升ms培養基中添加0.8mgnaa、1.5mg6-ba、30g蔗糖及8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至6.1，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.5。
將步驟2的無菌種苗移栽至ms-1培養基中以誘導形成愈傷組織，經測定，愈傷生成率為90％。培養條件為：溫度23～27℃、光照12h/d、培養基ph值為5.5，培養35～45天。
4.不定芽的獲得
向每升ms培養基中添加0.8mgnaa、0.5mg6-ba、30g蔗糖及6.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至6.1，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-2培養基，此時培養基的ph值為5.5。
將步驟3的愈傷組織從外植體上剝離下來後置於ms-2培養基中以誘導分化不定芽，經測定，幼芽生成率為92％。培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養基ph值為5.0，增殖培養3～5代。
5.根的誘導
將步驟4的不定芽移栽到ms-0培養基中以誘導生根，經測定，生根率為92％。其中：培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養時間17～22天。
6.煉苗移栽
將生根苗轉入大棚內煉苗2周後，採用環境條件逐漸過渡的方法進行移栽。經測定，移栽成活率為95％。
對比例1
1.種子的消毒
選取黑果枸杞種子，用70v％的酒精浸泡5min後再用0.1wt％的氯化汞溶液消毒15min，然後用無菌水衝洗3遍。
2.無菌種苗的獲得
向每升ms培養基中添加30g蔗糖和8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.8，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.2。
將步驟1的種子置於ms-0培養基中，待所述種子萌發至種苗長到葉片數為10～20片。
3.愈傷組織的誘導
向每升ms培養基中添加1.0mgnaa、2.0mg6-ba、30g蔗糖及8.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.8，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-0培養基，此時培養基的ph值為5.2。
將步驟2中生長良好的幼葉片橫向剪或切為直徑3～5mm的小塊(單片葉剪為2～3塊)後移栽至栽至ms-1培養基中以誘導形成愈傷組織，經測定，愈傷生成率為79％。培養條件為：溫度23～27℃、光照12h/d、培養基ph值為5.2，培養35～45天。
4.不定芽的獲得
向每升ms培養基中添加1.0mgnaa、1.0mg6-ba、30g蔗糖及6.0g瓊脂，用1mol/l的naoh溶液調節ph值至5.8，後用121℃高壓滅菌15min後得到ms-2培養基，此時培養基的ph值為5.2。
將步驟3的愈傷組織從外植體上剝離下來後置於ms-2培養基中以誘導分化不定芽，經測定，幼芽生成率為84％。培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養基ph值為5.2，增殖培養3～5代。
5.根的誘導
將步驟4的不定芽移栽到ms-0培養基中以誘導生根，經測定，生根率為87％。其中：培養條件為：溫度23～27℃、光照14h/d、培養時間17～22天。
6.煉苗移栽
將步驟5得到的生根苗轉入大棚內煉苗2周後，採用環境條件逐漸過渡的方法進行移栽。經測定，移栽成活率為89％。
顯然，上述實施例僅僅是為清楚地說明所作的舉例，而並非對實施方式的限定。對於所屬領域的普通技術人員來說，在上述說明的基礎上還可以做出其它不同形式的變化或變動。這裡無需也無法對所有的實施方式予以窮舉。而由此所引伸出的顯而易見的變化或變動仍處於本發明創造的保護範圍之中。