一種提高過氧化氫酶發酵產量的方法
2023-05-03 15:39:01
一種提高過氧化氫酶發酵產量的方法
【專利摘要】本發明提供了一種提高過氧化氫酶發酵產量的方法，是以2009年11月16日已保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC?No.?3449的一株高產過氧化氫酶的Serratia?marcesces?SYBC08菌株為出發菌種，經種子培養和在產酶培養基中添加100mg/L-200mg/L煙酸作為誘導劑後，調控了菌體的生理代謝，再進行深層發酵，可明顯提高過氧化氫酶的活力達1.3倍以上，相當於增加過氧化氫酶產量30％以上，且適用於工業化生產，所產過氧化氫酶可廣泛應用於紡織印染、造紙、工業廢水處理等領域，屬於生物【技術領域】。
【專利說明】一種提高過氧化氫酶發酵產量的方法
【技術領域】
[0001]本發明為一種提高過氧化氫酶發酵產量的方法，屬於生物【技術領域】。
【背景技術】
[0002]過氧化氫是一種很強的氧化劑，一直以來應用於食品工業作為殺菌劑和半導體工業作為矽片的洗滌劑。近年來過氧化氫被用於工業廢水處理中，其中最常用於含硫、含酚和含氰化物廢水的處理，以及氣體的洗滌、脫氯等。2006年，過氧化氫全世界的消費量大約220萬噸，這是20年前的2倍。但過氧化氫在工業產品和排放物中的殘留可能會引起人的身體健康惡化和環境汙染。過氧化氫酶(CAT)能有效地催化過氧化氫分解為無毒的水和氧氣，並且酶本身沒有害。另外在處理工業廢水中，H2O2中添加CAT可以促進降解芳環化合物和脂族化合物，H2O2中添加CAT處理生物過濾器，還可提高其對廢水脫臭效果。因此極大的刺激了微生物發酵產過氧化氫酶的研究熱情。
[0003]目前國內外CAT市場需求量大增，然而微生物產酶低而導致成本較高仍是目前有待解決的主要問題，因此發酵產CAT的調控機理已逐漸受到關注，不少學者提出了通過外源添加過氧化氫、活性氧、甲奈醌、乙醇誘導CAT表達的發酵策略，然而上述誘導物質存在發酵過程脅迫不易控制且操作複雜，產量提高非常有限，不適於工業化生產，這促使我們去探索研究既能提高過氧化氫酶產量又能適用工業化生產的方法，本發明就是在這樣的指導思想下，經過多次試驗獲得成功的。
【發明內容】
[0004]本發明研究出在產酶培養基中添加100mg/L-200mg/L煙酸作為誘導劑後，調控了菌體的生理代謝，再進行發酵，可明顯提高過氧化氫酶的活力達1.3倍以上，相當於增加過氧化氫酶產量30%以上，且適用於工業化生產。
[0005]本發明的技術方案:用以2009年11月16日已保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 3449的一株高產過氧化氫酶的Serratiamarcesces SYBC08菌株為出發菌種，經種子培養和在產酶培養基中添加100mg/L-200mg/L煙酸作為誘導劑後，調控了菌體的生理代謝，再進行深層發酵，可顯著過氧化氫酶的產量，且適用於工業化生產，工藝為:
[0006](1)種子培養
[0007]LB平板培養基:蛋白腖10g/L，氯化鈉5g/L，酵母浸膏5g/L，瓊脂25g/L，121°C滅菌30分鐘，冷卻。
[0008]種子培養基:葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉5g/L，牛肉膏5g/L，121°C滅菌30分鐘，冷卻。
[0009]從斜面上挑取單菌落，劃線於LB平板培養基，將平板置於30°C培養箱培養24h。再從平板上括取兩環菌種接種到含50mL種子培養基的250mL三角瓶進行培養，培養條件:PH7.0，培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，即為發酵種子液。[0010]⑵發酵產酶
[0011 ]產酶培養基:20g/L ~40g/L 玉米漿粉，20g/L ~40g/L 檸檬酸，100mg/L-200mg/L煙酸，消泡劑0.2-0.5g/L，121°C滅菌30分鐘，冷卻。
[0012]以2%接種量將發酵種子液接種到含5L產酶培養基的7L發酵罐進行發酵產酶。
[0013]發酵條件:ρΗ6.5~8.0，溫度30~34°C，發酵時間25~30h，轉速300~500r/min,通氣量 L 2 ~L 7L/min/L。
[0014](3)過氧化氫酶提取
[0015]將發酵液進行離心或過濾，收集的菌體細胞採用高壓細胞破碎，破碎機壓力控制在2000bar及以上，破碎菌液按過氧化氫酶活力測定方法測定酶活力並按發酵液等體積計算CAT產量U/ml。
[0016](4)酶活的測定方法
[0017]3ml 反應體系中包括粗酶液 0.lml, pH = 7.00 的 lmol/L Na2HPO4-NaH2PO4 緩衝液
2.4ml，新鮮配製的0.12mol/L H2O2溶液0.5ml。以去離子水替代H2O2溶液作為空白對照，以波長240nm體系下吸光度的下降來衡量過氧化氫的酶促降解速度，每隔IOs讀取一次吸光度值，一般持續進行Imin後停止測定，以反應的線性範圍計算酶活U/ml，一個標準酶活力定義為:在最適溫度下，每分鐘分解I μ moIH2O2所需的酶量。
[0018]本發明的有益效果:
[0019]本發明的方法可較大幅度的提高過氧化氫酶的產量且可工業化生產，所生產製備出來的過氧化氫酶可廣泛應用於紡 織印染、造紙、廢水處理等方面。因此本發明有廣泛的工業使用價值和較好的經濟效益前景。
【具體實施方式】
[0020]對照實施例1:
[0021]從斜面上挑取單菌落，劃線於LB培養基中,將平板置於30°C培養箱培養24h。從平板上括取兩環菌種接種到含50mL培養基的250mL三角瓶進行培養。培養條件:pH7.0,培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，再以2%接種量接種到含5L沒有加煙酸的產酶培養基的7升發酵罐進行發酵試驗:培養條件為控制pH為7.5，培養時間25h，溫度30°C，轉速300rpm，通氣量1.7L/min/L，發酵液酶活力達19520.1 U/ml ?
[0022]種子培養基如上所述；產酶培養基為20g/L玉米漿粉，20g/L檸檬酸。
[0023]實施例1
[0024]從斜面上挑取單菌落，劃線於LB培養基中,將平板置於30°C培養箱培養24h。從平板上括取兩環菌種接種到含50mL培養基的250mL三角瓶進行培養。培養條件:pH7.0，培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，再以2%接種量接種到含5L加煙酸產酶培養基的7升發酵罐進行發酵試驗:培養條件為控制pH為7.5，培養時間25h，溫度30°C，轉速300rpm，通氣量1.7L/min/L，發酵液酶活力達25616.3U/ml，酶活力較對照實施例1提高了1.312倍，相當於過氧化氫酶產量提高了 31.2%。
[0025]種子培養基如上所述；產酶培養基為20g/L玉米漿粉，20g/L檸檬酸，煙酸IOOmg/L ;消泡劑加0.2g/L
[0026]實施例2[0027]從斜面上挑取單菌落，劃線於LB培養基中，將平板置於30°C培養箱培養24h。從平板上括取兩環菌種接種到含50mL培養基的250mL三角瓶進行培養。培養條件:pH7.0，培養時間12h，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，再以2%接種量接種到含5L加煙酸產酶培養基的7升發酵罐進行發酵試驗:培養條件為控制pH為6.5，培養時間30h，溫度34°C，轉速500rpm，通氣量1.2L/min/L，發酵液酶活力達27285.5U/ml，酶活力較對照實施例1提高了
1.397倍，相當於過氧化氫酶產量提高了 39.7%。
[0028]種子培養基如上所述；產酶培養基為40g/L玉米漿粉，40g/L檸檬酸，煙酸200mg/L ;消泡劑加0.5g /L。
【權利要求】
1.一種提高過氧化氫酶發酵產量的方法，其特徵在於:以已保存於中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC 3449,分類命名為Serratia marcescesSYBC08為出發菌種，經種子培養和在產酶培養基中添加100mg/L-200mg/L煙酸作為誘導劑後，再進行深層發酵，可顯著提高過氧化氫酶的活力達1.3倍以上，相當於增加過氧化氫酶產量30%以上，且適用於工業化生產，工藝為: (1)種子培養 LB平板培養基:蛋白腖10g/L，氯化鈉5g/L，酵母浸膏5g/L，瓊脂25g/L，121°C滅菌30分鐘，冷卻； 種子培養基:葡萄糖20g/L，蛋白腖10g/L，氯化鈉5g/L，牛肉膏5g/L，121°C滅菌30分鐘，冷卻； 從斜面上挑取單菌落，劃線於LB平板培養基,將平板置於30°C培養箱培養24小時，再從平板上括取兩環菌種接種到含50mL種子培養基的250mL三角瓶進行培養，培養條件:PH7.0，培養時間12小時，溫度30°C，搖瓶轉速200r/min，即為發酵種子液； (2)發酵產酶 產酶培養基:20g/L~40g/L玉米漿粉，20g/L~40g/L檸檬酸，100mg/L-200mg/L煙酸，消泡劑0.2-0.5g/L，121°C滅菌30分鐘，冷卻； 以2%接種量將發酵種子液接種到含5L產酶培養基的7L發酵罐進行發酵產酶； 發酵條件:pH6.5~7.5，溫度30~34°C，發酵時間25~30h，轉速300~500r/min，通氣量 1.2 ~1.7L/min/L ； (3)過氧化氫酶提取` 將發酵液進行離心或過濾，收集的菌體細胞採用高壓細胞破碎，破碎機壓力控制在2000bar及以上，破碎菌液按過氧化氫酶活力測定方法測定酶活力並按發酵液等體積計算CAT 產量 U/ml ； (4)酶活的測定方法 3ml 反應體系中包括粗酶液0.lml,pH = 7.00 的 lmol/L Na2HPO4-NaH2PO4緩衝液2.4ml，新鮮配製的0.12mol/L H2O2溶液0.5ml,以去離子水替代H2O2溶液作為空白對照，以波長240nm體系下吸光度的下降來衡量過氧化氫的酶促降解速度，每隔IOs讀取一次吸光度值，一般持續進行Imin後停止測定，以反應的線性範圍計算酶活U/ml，一個標準酶活力定義為:在最適溫度下，每分鐘分解I μ moIH2O2所需的酶量。
【文檔編號】C12R1/43GK103509765SQ201210211313
【公開日】2014年1月15日 申請日期:2012年6月26日 優先權日:2012年6月26日
【發明者】張峰, 李洪兵, 張明 申請人:湖南鴻鷹祥生物工程股份有限公司