適於mdck細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基的製作方法

2023-05-11 08:21:46

專利名稱：適於mdck細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基的製作方法
適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血
清土甘養基
技術領域：
本發明涉及現代生物技術之培養基研發技術領域，具體地說，是一種適於MDCK細 胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基。
技術背景
防止病毒危害人類是各國都非常關心的事情。多少年來，人類每年因病毒的侵害 而蒙受巨大的損失，如狂犬病、禽流感對人類的危害。狂犬病是由狂犬病病毒引起的，是危 害非常嚴重的傳染疾病之一， 一旦發病，死亡率非常高，而且至今除預防的疫苗外沒有特殊 有效的治療藥物。此外，流感病毒引起的危害也非常大，每年都會有5 15%的人被季節性 流感感染，有300 500萬個嚴重病例，有高達50萬人因之死亡。更為嚴重的是，現在的流 感病毒變異後可由禽類傳染給人，禽流感就曾肆虐了全球多個國家，給人類造成了嚴重危 害。有調查表明，1989年法國因流感而消耗的衛生服務費約為19億法郎，潛在的經濟損失 為143億法郎。美國每年因流感而導致的直接經濟損失為10 30億美元，潛在的經濟損 失為100 150億美元。中國香港地區因禽流感損失估計高達8000萬港幣。由此可見，防 止病毒危害人類是項重要而緊迫的工作。 目前已上市的流感疫苗基本上都是用雞胚培養製取的。雞胚在疫苗的生產中被用 作培養介質，使用的雞胚必須要能保證培養病毒的存活，屬於病毒生長所需的特殊環境。因 此，一般須使用健康雞群產下的受精卵，要求產蛋雞的年齡不能超過1歲，同時，必須對雞 群進行定期檢測，確保在生長過程中不受相關疾病的影響，確保受精卵內也不存在任何病 毒。由於受到這些因素的限制，所以雞胚的供應量一直較小。由於雞胚帶有潛在汙染的可 能，且培養周期長，不易控制產量，不利於大規模應用，因此，美國等一些國家和世界衛生組 織都鼓勵發展細胞培養技術以替代目前的雞胚培養技術用於流感疫苗的生產。
應用動物細胞成規模生產流感疫苗，是將病毒適應到傳代細胞，並在生物反應器 上進行大規模的病毒繁殖和培養以實現流感疫苗的規模化生產，其優點主要是(l)可完 全避免雞胚中的蛋白質引起的不良反應，有利於提高疫苗質量；(2)克服雞胚要求嚴，來源 少的問題，可降低生產成本；(3)細胞培養體系易於放大，且病毒繁殖快，更易滿足市場的 需求。 目前以細胞培養製備疫苗最為廣泛的是Vero、MDCK和PER.C6三個細胞系。其中 的MDCK細胞是一種非常重要的動物細胞系，它可以用來生產弱化的病毒，進而用於病毒疫 苗的生產，如流感和狂犬病疫苗的生產。用MDCK細胞生產疫苗有很多優點首先，MDCK細 胞培養容易，增殖快，生產周期短，易於放大；其次，與雞胚生產的病毒相比，用MDCK細胞生 產的病毒與從人體分離的病毒更加相似，性質更均一，病毒表面糖蛋白不易發生變異，感染 效率高；再次，用MDCK細胞生產的疫苗也適用於對雞胚蛋白過敏的患者；最後，由於生產過 程中不涉及人的細胞和動物個體，不會引起倫理學紛爭。 但是，傳統的MDCK細胞生產疫苗的過程需要用血清。使用血清有幾個明顯的缺點首先，因動物個體不同，血清產地、批號不同，血清的批次質量差異甚大，使得實驗和生 產的標準化困難；其次，血清的成分複雜，其中既含有促進一些細胞生長的成分，也含有抑 制另一些細胞生長的成分，並且還含有對細胞產生毒性的物質，如補體、抗體、細菌毒素等， 會影響細胞的生長，甚至造成細胞的死亡；再次，在血清的取材中可能帶入支原體、病毒，對 細胞產生潛在影響，可能導致實驗失敗或實驗結果不可靠性；第四、應對大規模生產時，血 清的來源越來越困難，且價格昂貴；最後、血清的引入還會加大產品下遊分離純化的困難， 增加生產成本，很難實現規範生產，並可能帶來安全隱患。 現在，由於在強力推行GMP規範，有血清的細胞培養系統將會失去其應用的市場， 因此，迫切需要開發MDCK細胞的無血清培養基。 用無血清培養基進行細胞培養從1911年就開始研究了，目前多數細胞已經能在 無血清培養系統中正常地生長和增殖。MDCK細胞的無血清培養基近些年也有了很大的發 展。 1979年Mary Taub等人開發出的MediumK-l無血清培養基能支持貼壁的MDCK細 胞生長，但該培養基含多種激素和生長因子，成分複雜。1994年法國的0. -W. Merten等人開 發了無血清培養基MDSS2， 1996年對其改進後得到MDSS2N(用植物來源組分代替動物來源 組分)。這兩種培養基均可用於MDCK細胞貼壁培養，但是細胞生長慢，延滯期長(約48小 時)，不能達到很高的細胞密度。 2001年美國Sigma-Aldrich公司的St. Louis等人開發出無血清培養基MDCK-LP 和匪DCK-LPM ;2005年日本Kyoritsu Seiyaku集團的MasamiMochizuki開發出無血清低蛋 白RPMI/SP培養基。這些培養基雖然都能支持MDCK細胞貼壁生長，但細胞生長緩慢，培養 周期長。 近幾年有文獻報導，美國JRH Bioscience的商業培養基Ex-Cell MDCK和Gibco公 司的無血清商業培養基EpiSerf可以支持MDCK細胞貼壁生長。美國Sigma-Aldrich的分公 司SAFC生物科學2006年推出了一種無血清無動物蛋白的商業培養基Ex-Cell MDCK，並宣 稱該培養基能夠支持MDCK細胞貼壁和單細胞懸浮生長，但是，直到目前尚未有文獻報導該 培養基培養單細胞懸浮的MDCK細胞。這些商業培養基雖然能夠支持細胞穩定生長和用於 生物製品的生產，但也存在一些明顯的缺點，例如成分保密，化學成分不明確，給科研和生 產過程帶來困難；價格都比較昂貴，只適用於部分小規模的實驗研究而不適合大規模生產； 只能支持MDCK細胞貼壁生長，在大規模培養過程中多採用微載體等細胞貼附基質，既增加 了成本也為生物製品的後期純化帶來了麻煩。 利用MDCK細胞無血清懸浮生產生物製品，既可避免有血清培養的種種不利因素， 又可以消除引用微載體所帶來的其他影響，從而提高MDCK細胞培養的生產效率並降低生 產成本，同時確保產品的質量，具有良好的應用價值和巨大的市場前景。

發明內容
本發明的目的在於克服現有技術存在的缺陷，提供一種適於MDCK細胞大規模貼 壁培養或單細胞懸浮培養的無血清培養基，其有明確的培養基組分，能去除血清對生產過 程的幹擾，降低生產成本，實現MDCK細胞高密度貼壁培養和單細胞懸浮培養，突破MDCK細 胞對貼附基質的依賴，為生物製品的規模化生產提供方便。
為實現上述目的，本發明採取的技術方案為 —種適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，其特徵 在於，包括21種胺基酸、6種維生素、8種鹽類、8種脂類、4種微量元素、2種緩衝劑、1種蛋 白水解物、1種酸鹼指示劑以及6種其他添加物；—所述的21種胺基酸為丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨 酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯 氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸； ——所述的6種維生素為生物素、葉酸、煙醯胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸； ——所述的8種鹽類為氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷
酸二氫鈉、丙酮酸鈉； ——所述的8種脂類為膽固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂 酸、吐溫80、嵌段式聚醚F68 ;



-所述的4種微量元素為硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、亞硒酸鈉； -所述的2種緩衝劑為碳酸氫鈉、羥乙基哌嗪乙磺酸； -所述的蛋白水解物為胰蛋白水解物； -所述的酸鹼指示劑為酚紅；
-所述的6種其他添加物為葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、轉鐵蛋白、白蛋白、胰島



















所述的胺基酸的含量為
3 6毫克/升，
天冬醯胺
半胱氨酸
穀氨醯胺 甘氨酸
甲硫氨酸
50 5 2 5 10 7 100 5 10 20 30 50 10 20 2 10 10 5 30
-200毫克/升， 15毫克/升， 15毫克/ 30毫克/ -40毫克 20毫克/
1000導
30毫克, -50毫克 -60毫 -70毫 -150 ， -30毫
-50 30導 -40 -60 20導 -70
i克/ i克/ 毫克 i克/ i克/ 克/ i克 i克 克/ i克
升， 升，
z升， 升， 克/升， 升， z升， z升， z升，
升，
z升， z升，
升，
z升， z升，
升，
'升，
830 70
所述的維生素的含J
生物素 葉酸 煙醯胺 吡眵醇
0. 003
2 5 2 1 1 0. 1
升'
毫克
l:為 o. i毫克
:克/升，
升，
10
5 ; 5 ;
硫辛酸 所述的鹽類的含 20
氯化鎂 硫酸鎂 氯化鈣 氯化鉀 氯化鈉 磷酸氫二鈉
20 150 -300 -1000 50
磷酸二氫鈉50-丙酮酸鈉 50 -所述的脂類的含J 膽固醇 1 5 生育酚醋酸酯 豆蔻酸 0.005 棕櫚酸 棕櫚油酸 硬脂酸 吐溫80
嵌段式聚醚F68 所述的微 硫酸銅 硝酸鐵 硫酸亞鐵 亞硒酸鈉
0. 005 0. 005 0. 005
1
克 毫克/ 毫克/ '0. 5 I
l:為
100毫 100毫 -200毫 -500毫 7000 100 ; 100 ; 150 ;
l:為
毫克/
0. 005 0. 1 0. 1 0. 1 0. 1 3. 1 S 0. 1
/升，
升，
升，
克/升。
克/ 克/ i克 i克
凍 凍 凍
'升， '升， /升， /升， 克/升， 升， 升， 升。
升，
'0. 1毫克
:克/升，
升，
凍/升， 凍/升， 凍/升， 〖克/升，
2000毫克/升。 t元素的含量為 5 20毫克/升， 20 100毫克/升， 0. 1 0. 6毫克/升， 50 150毫克/升。 所述的緩衝劑的含量為 碳酸氫鈉 1000 3700毫克/升， 羥乙基哌嗪乙磺酸 1000 5000毫克/升< 所述的蛋白水解物的含量為胰蛋白水解物 所述的酸鹼指示劑的含量為酚紅5 10 : 所述的其他添加物的含量為 葡萄糖 1000 6000毫克/升，
次黃嘌呤 2 10毫克/升，
1500 3000
i克/升。
:克/升:
胸苷 0. 1 0. 8毫克/升， 轉鐵蛋白 5 30毫克/升，
白蛋白 20 300毫克/升，
胰島素 5 50毫克/升。 —種適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，含有種 胺基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩衝劑、蛋白水解物、酸鹼指示劑以及添加物，其特 徵在於，其各種組分的含量為(毫克/升)
0090]硫酸銅(Cupric Sulfate Pentehyd:rate)5 20
0091]石肖酸鐵(Ferric Nitrate Nonahydrate)20 -100
0092]硫酸亞鐵(Ferrous Sulfate H印tahydrate)0. 1 0. 6
0093]氯化續(Magnesium Chloride Hexahydrate)20 -100
0094]硫酸鎂(Magnesium Sulfate)20 -100
0095]氯化牽丐(Calcium Chloride Dihydrate)150 200
0096]氯化鉀(Potassium Chloride)300 500
0097]碳酸氧納(Sodium Bicarbonate)100C 370
0098]氯化鈉(Sodium Chloride)100C 700
0099]磷酸氫二鈉(Dibasic Sodium Phosphate)50 - 100
0100]憐酸二氧納(Sodium Dihydrogen Phosphate)50 -100
0101]丙氨酸(L-Alanine)3 6
0102]精氨酸(L_Arginine Hydrochloride)50 -200
0103]天冬酉先胺(X_Asparagine Monohydrate)5 15
0104]天冬氨酸(X-Aspartic cid)2 15
0105]月光氨酸(X-Cystine Dihydrochloride)5 30
:0106]半胱氨酸(L-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)10 - 40
:0107]穀氨酸(L-Glutamic Acid)7 20
:0108]穀氨醯胺(L-Glutamine)100 1000
:0109]甘氨酸(Glycine)5 30
:o"o]組氨酸(L_Histidine Hydrochloride Monohydrate)10 -50
:o川]異亮氨酸(L-Isoleucine)20 - 60
:0112]亮氨酸(X-Leucine)30 - 70
:o"3]賴氨酸(X-Lydine hydrochloride)50 - 150
:o"4]甲硫氨酸(L-Methionine)10 - 30
:o"5]苯丙氨酸(X-PhenylalMiine)20 - 50
:o"6]脯氨酸(L-Proline)2 30
:o"7]絲氨酸(L-Serine)10 - 40
:o"8]蘇氨酸(L-Threonine)10 - 60
:o"9]色氨酸(L-Tryptophan)5 20
:0120]酪氨酸(X_Tyrosine Disodium Dihydrate)30 - 70
:0121]纈氨酸(L-Valine)30 - 70
10
生物素(D-Biotin)0. 003 0. 1葉酸(Folic Acid)2 5煙醯胺(Niacinamide)2 10妣口多酉享(Pyridoxine Hydrochloride)1 5硫胺素(Thiamine Hydrochloride)1 5硫辛酸(Lipoic Acid)0. 1 0. 5葡萄糖(D"Glucose)1000 6000丙嗣酸納(Sodium Pyruvate)50 150次黃嘌呤(Hypoxanthine)2 10胸苷(Thymidine)0. 1 0. 8羥乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid)1000 5000膽固醇(Cholesterol)1 5生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate)a 005 a i豆蔻酸(Myristic Acid)a 005 a i棕櫚酸(Palmitic Acid)a 005 a i棕櫚油酸(Palmitoleic Acid)a 005 a i硬脂酸(Stearic Acid)a 005 a i吐^U80(Tween 80)1 3. 1轉鐵蛋白(Transferrin)5 30白蛋白(Bovine Serum Albumin)20 300胰島素(Insulin)5 50亞硒酸鈉(Sodium Selenite)50 150月貞gfiTKf肖力(Lucaratone Tryptone USP)1500 3000嵌段式聚醚F68(Pluronic F68)0. 1 2000酚紅(Sodium Phenol Red)5 10本發明的無血清培養基主要是採用硝酸鐵、轉鐵蛋白、亞硒酸鈉、胸苷、次黃嘌呤、白蛋白和胰島素等物質代替血清，以膽固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬
脂酸、吐溫80和嵌段式聚醚F68的組合物為MDCK細胞提供生長必需的脂類物質，同時加入 胺基酸、維生素、鹽類、微量元素和蛋白水解物等物質促進細胞生長與維持。其中，胺基酸是 生物功能大分子蛋白質的基本組成單位，為細胞生長、進行正常代謝和維持生命提供了物 質基礎；維生素是細胞代謝中必不可少的有機化合物，許多維生素是酶的輔酶或者是輔酶 的組成分子，細胞的各種生長代謝活動離開了維生素都無法正常進行；鹽類可以調節細胞 膜的通透性，控制水分，維持正常滲透壓和酸鹼平衡，維持細胞的形態和功能，有些為無機 或有機化合物以構成酶的輔基、激素、維生素、蛋白質和核酸的成分，或作為多種酶系統的 激活劑，參與許多重要的重理功能；脂類具有能量儲存、構成生物膜骨架、參與信號傳遞、酶 激活劑、糖基載體、生長因子與抗氧化劑激素、參與信號識別和免疫、作為維生素和色素的 前體等生物學功能；微量元素通過與蛋白質和其他有機基團結合，形成了酶、激素、維生素 等生物大分子，發揮著重要的生理生化功能；緩衝劑能維持培養基正常滲透壓和酸鹼平衡， 維持細胞的形態和功能；蛋白水解物為細胞生長提供重要的胺基酸、短肽等營養物，促進細胞生長；酸鹼指示劑可以在線指示細胞培養液的酸鹼度變化，方便更換新鮮培養液、細胞傳 代等操作；其他添加物中包括能源物質和血清替代物。 本發明所述的無血清培養基可採用常規的製備方法製取，S卩，將上述組分溶解於 無熱源超純水即可配製得所述的培養基。 本發明所述的無血清培養基的使用方法也為常規方法。
本發明的積極效果為 (1)不含血清，組分明確，有利於產物的分離純化，提高產品品質； (2)支持MDCK細胞長期傳代培養，無需長期而複雜的適應過程； (3)能良好地支持MDCK細胞的貼壁生長，其最高細胞密度接近甚至超過有血清培
養基和已知的商業培養基； (4)能良好地支持MDCK細胞的單細胞懸浮生長，培養過程中無需使用微載體等支 持細胞依附的基質，從而能有效地降低生產成本，減少生物製品的後期分離純化負擔；
(5)組分明確，適合對細胞進行生長代謝、病毒擴增等方面的研究工作；
(6)成分簡單、配製和使用容易、成本不高，適於大規模生產。


附圖1為MDCK細胞在本發明的無血清培養基中貼壁培養的生長曲線坐標圖；
附圖2為MDCK細胞在本發明的無血清培養基中單細胞懸浮培養的生長曲線坐標 圖； 圖中的標識分別為 ~4~活細胞密度；~▲~比生長速率。
具體實施方式
以下介紹本發明適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養
基的具體實施方式
，提供2個實施例，但本發明的實施不限於以下的實施例。 實施例1 —種適於MDCK細胞大規模貼壁和單細胞懸浮培養的無血清培養基，包括胺基酸、 維生素、鹽類、脂類、微量元素、激素、緩衝劑、蛋白水解物及添加物，其各種成分的含量為
毫克/升硫酸銅(Cupric Sulfate Pentehydrate)15. 97石肖酸鐵(Ferric Nitrate Nonahydrate)20. 02硫酸亞鐵(Ferrous Sulfate H印tahydrate)0. 417氯化續(Magnesium Chloride Hexahydrate)61. 2硫酸鎂(M卿esium Sulfate)48. 84氯化牽丐(Calcium Chloride Dihydrate)154. 5氯化鉀(Potassium Chloride)311. 8碳酸氧納(Sodium Bicarbonate)1200氯化鈉(Sodium Chloride)6996憐酸氧二納(Dibasic Sodium Phosphate)71. 02憐酸二氧納(Sodium Dihydrogen Phosphate) 54. 3丙氨酸(L-Alanine) 4. 45精氨酸<X-Arginine Hydrochlori de)147. 5天冬酉先胺(X_Asparagine Monohydrate) 7. 5天冬氨酸(L-Aspartic cid) 6. 65胱氨酸(L-Cystine Dihydrochloride)17. 56半胱氨酸(X-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)31. 29穀氨酸(L-Glutamic Acid)7. 35穀氨醯胺(L-Glutamine)292甘氨酸(Glycine)18. 75組氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate)31. 48異亮氨酸(L-Isoleucine)54. 47亮氨酸Heucine)59. 05賴氨酸Hydine hydrochloride)91. 25甲硫氨酸(L-Methionine)17. 24苯丙氨酸(L-Phenylalanine)35. 48脯氨酸(L-Proline)17. 25絲氨酸(L-Serine)26. 25蘇氨酸(L-Threonine)53. 45色氨酸(L-Tryptophan)9. 02酪氨酸(X_Tyrosine Disodium Dihydrate)55. 79纈氨酸(L-Valine)52. 85生物素(D-Biotin)0. 0035葉酸(Folic Acid)2. 66煙醯胺(Niacinamide)2. 02卩比卩多醇(Pyridoxine Hydrochloride)2硫胺素(Thiamine Hydrochloride)2. 17硫l辛酸(Lipoic Acid)0. 105葡萄糖(D-Glucose)3151丙酮酸鈉(Sodium Pyruvate)55次黃嘌呤(Hypoxanthine)2. 1胸苷(Thymidine)0. 365羥乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid)3574. 5膽固醇(Cholesterol)3. 87生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate)0. 03豆蔻酸(Myristic Acid)0. 005棕櫚酸(Palmitic Acid)0. 005棕櫚油酸(Palmitoleic Acid)0. 005硬脂酸(Stearic Acid)0. 005
吐溫80(Tween 80) 1.1 轉鐵蛋白(Transferrin) 10 白蛋白(Bovine Serum Albumin) 100 胰島素(Insulin) 10 亞硒酸鈉(Sodium Selenite) 81.47 胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP) 2100 嵌段式聚醚F68(Pluronic F68) 0.1 酚紅(Sodium Phenol Red) 8. 63 將上述組分溶解於無熱源超純水中進行配製，可得適合MDCK細胞大規模貼壁培 養的無血清培養基。 將用於生產狂犬病毒疫苗和流感病毒疫苗的MDCK細胞置於本發明所述的無血清 培養基中進行貼壁培養接種於50平方釐米的方瓶中，培養液體積為20毫升，接種密度為 1. 8 X 105細胞/毫升，培養至84小時時的活細胞密度達到最高，為11. 02 X 105細胞/毫升， 其結果見附圖1。
實施例2 —種適於MDCK細胞大規模貼壁和單細胞懸浮培養的無血清培養基，包括胺基酸、 維生素、鹽類、脂類、微量元素、激素、緩衝劑、蛋白水解物及添加物，其各種成分的含量為
毫克/升硫酸銅(Cupric Sulfate Pentehydrate)15. 97石肖酸鐵(Ferric Nitrate Nonahydrate)40. 04硫酸亞鐵(Ferrous Sulfate H印tahydrate)0. 6氯化續(Magnesium Chloride Hexahydrate)61. 2硫酸鎂(M卿esium Sulfate)48. 84氯化牽丐(Calcium Chloride Dihydrate)154. 5氯化鉀(Potassium Chloride)311. 8碳酸氧納(Sodium Bicarbonate)1200氯化鈉(Sodium Chloride)6996憐酸氧二納(Dibasic Sodium Phosphate)71. 02憐酸二氧納(Sodium Dihydrogen Phosphate)54. 3丙氨酸(L-Alanine)4. 45精氨酸(L_Arginine Hydrochloride)147. 5天冬酉先胺(L_Asparagine Monohydrate)7. 5天冬氨酸(L-Aspartic cid)6. 65胱氨酸(X_Cystine Dihydrochloride)17. 56半胱氨酸(X-Cysteine Hydrochloride Monohydrate)31. 29穀氨酸(L-Glutamic Acid)7. 35穀氨醯胺(L-Glutamine)584甘氨酸(Glycine)18. 75組氨酸(L_Histidine Hydrochloride Monohydrate) 1431. 48
異亮氨酸(L-Isoleucine)54. 47亮氨酸(Heucine)59. 05賴氨酸(X-Lydine hydrochloride)91. 25甲硫氨酸(L-Methionine)17. 24苯丙氨酸(X-PhenylalMiine)35. 48脯氨酸(L-Proline)17. 25絲氨酸(L-Serine)26. 25蘇氨酸(L-Threonine)53. 45色氨酸(L-Tryptophan)9. 02酪氨酸(X_Tyrosine Disodium Dihydrate)55. 79纈氨酸(L-Valine)52. 85生物素(D-Biotin)0. 0035葉酸(Folic Acid)2. 66煙醯胺(Niacinamide)2. 02口比卩多醇(Pyridoxine Hydrochloride)2硫胺素(Thiamine Hydrochloride)2. 17硫辛酸(Lipoic Acid)0. 105葡萄糖(D-Glucose)4500丙酉同酸納(Sodium Pyruvate)110次黃嘌呤(Hypoxanthine)2. 1月匈昔(Thymidine)0. 365羥乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl PiperazineEthanesulfonic Acid)3574. 5膽固醇(Cholesterol)3. 87生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate)0. 07豆蔻酸(Myristic Acid)0. 01棕櫚酸(Palmitic Acid)0. 01棕櫚油酸(Palmitoleic Acid)0. 01硬脂酸(Stearic Acid)0. 01吐溫80(Tween 80)2. 2轉鐵蛋白(Transferrin)10白蛋白(Bovine Serum Albumin)100胰島素(Insulin)10亞硒酸鈉(Sodium Selenite)81. 47胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP)2100嵌段式聚醚F68(Pluronic F68)1000酚紅(Sodium Phenol Red)8. 63將上述組分溶解於無熱源超純水中進行配製，可得適合MDCK細胞大規模貼壁培養的無血清培養基。 將用於生產狂犬病毒疫苗和流感病毒疫苗的MDCK細胞置於本發明所述的無血清培養基中進行單細胞懸浮培養接種於美國Corning公司的500毫升攪拌瓶中，培養液體積 為150毫升，接種密度為3. 38X 105細胞/毫升，培養至84小時時活細胞密度達到最高，為 38. 05XlQ5細胞/毫升，結果見附圖2。
權利要求
一種適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，包括21種胺基酸、6種維生素、8種鹽類、8種脂類、4種微量元素、2種緩衝劑、1種蛋白水解物、1種酸鹼指示劑以及6種其他添加物；——所述的21種胺基酸為丙氨酸、精氨酸、天冬醯胺、天冬氨酸、胱氨酸、半胱氨酸、穀氨酸、穀氨醯胺、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸、纈氨酸；——所述的6種維生素為生物素、葉酸、煙醯胺、吡哆醇、硫胺素、硫辛酸；——所述的8種鹽類為氯化鎂、硫酸鎂、氯化鈣、氯化鉀、氯化鈉、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、丙酮酸鈉；——所述的8種脂類為膽固醇、生育酚醋酸酯、豆蔻酸、棕櫚酸、棕櫚油酸、硬脂酸、吐溫80、嵌段式聚醚F68；——所述的4種微量元素為硫酸銅、硝酸鐵、硫酸亞鐵、亞硒酸鈉；——所述的2種緩衝劑為碳酸氫鈉、羥乙基哌嗪乙磺酸；——所述的蛋白水解物為胰蛋白水解物；——所述的酸鹼指示劑為酚紅；——所述的6種其他添加物為葡萄糖、次黃嘌呤、胸苷、轉鐵蛋白、白蛋白、胰島素。
2. 根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清 培養基，其特徵在於，所述的胺基酸的含量為3 6毫克/升， - 200毫克/升， 15毫克/升，天冬醯胺半胱氨酸穀氨醯胺 甘氨酸甲硫氨酸[50[5 -[2 -[5 -[10[7 -100 5 10 ' 20 ' 30 ' 50 ' 10 ' 20 ' 2 10 ' 10 ' 5 30 ' 30 '克/ 克/ t克 克/ iooo;30毫克[15 ; 30 ; '40 20 ;- 50 ;- 60 ;- 70 ;- 150- 30 ;- 50 ; 30毫- 40 ;- 60 ; 20毫- 70 ; 一 70 ;設/ 設/ 設/ 毫克 設/ 設/ :克/ 設/ 設/ :克/ 設/ 設/升， 升，'升， 升， l克， '升， ,升， ,升， ,升， /升， ,升， ,升， 升， ,升， ,升， 升， ,升， '升。升，
3.根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清 培養基，其特徵在於，所述的維生素的含量為生物素 葉酸 煙醯胺 吡眵醇0. 0032 5 2 1 1 0. 1-0. 1毫克〖克/升，升，105 ; 5 ;t克/升， 克/升， 克/升，硫辛酸 0. 1 0. 5毫克/升。
4.根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清 培養基，其特徵在於，所述的鹽類的含量為氯化鎂 硫酸鎂 氯化鈣 氯化鉀20 -20 -150 300100 3 100 3 - 200 一 500:克/升， :克/升，S克/升，s克/升，氯化鈉1000 7000黴i克/升，磷酸氫二鈉50 100 '毫克/升，磷酸二氫鈉50 100 '毫克/升，丙酮酸鈉50 150 '毫克/升。
5.根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清 培養基，其特徵在於，所述的脂類的含量為膽固醇 生育酚醋酸酯棕櫚酸 棕櫚油酸 硬脂酸 吐溫80嵌段式聚醚F681 5毫 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 1 3. 1克/升， 0. 1毫克0. 1 !0. 1 !0. 1 !0. 1 !毫克0. 12000i克 i克 i克 i克 /升， :克/升升， 升， 升， 升， 升，
6. 根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清 培養基，其特徵在於，所述的微量元素的含量為硫酸銅 5 20毫克/升， 硝酸鐵 20 100毫克/升， 硫酸亞鐵 0. 1 0.6毫克/升， 亞硒酸鈉 50 150毫克/升。
7. 根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清 培養基，其特徵在於，所述的緩衝劑的含量為碳酸氫鈉 1000 3700毫克/升，羥乙基哌嗪乙磺酸1000 5000毫克/升。
8. 根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述的蛋白水解物的含量為胰蛋白水解物1500 3000毫克/升；所 述的酸鹼指示劑的含量為酚5 10毫克/升。
9. 根據權利要求1所述的適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，其特徵在於，所述的其他添加物的含量為葡萄糖1000 6000毫克/升， 次黃嘌呤 2 10毫克/升， 胸苷 0. 1 0.8毫克/升，轉鐵蛋白 5 30毫克/升， 白蛋白 20 300毫克/升， 胰島素 5 50毫克/升。
10. —種適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，含有種氨 基酸、維生素、鹽類、脂類、微量元素、緩衝劑、蛋白水解物、酸鹼指示劑以及添加物，其特徵 在於，其各種組分的含量毫克/升為硫酸銅(C叩ric Sulfate Pentahydrate) 5 20石肖酸鐵(Ferric Nitrate Nonahydrate) 20 100硫酸亞鐵(Ferrous Sulfate H印tahydrate) 0. 1 0. 6氯化續(Magnesium Chloride Hexahydrate) 20 100硫酸鎂(Magnesium Sulfate) 20 100tH七f丐(Calcium Chloride Dihydrate) 150 200氯化鉀(Potassium Chloride) 300 500碳酸氫鈉(Sodium Bicarbonate ) 1000 3700氯化鈉(Sodium Chloride) 1000 7000石粦酸氫二鈉(Dibasic Sodium Phosphate) 50 100憐酸二氧納(Sodium Dihydrogen Phosphate) 50 100丙氨酸(L-Alanine) 3 6精氨酸(L_Arginine Hydrochloride) 50 200天冬酉先胺(X-Asparagine Monohydrate) 5 15天冬氨酸(X-Aspartic cid) 2 15胱氨酸(X-Cystine Dihydrochloride) 5 30 半胱氨酸(X_Cysteine Hydrochloride Monohydrate)10 40穀氨酸(L-Glutamic Acid) 7 20穀氨醯胺(L-Glutamine) 100 1000甘氨酸(Glycine) 5 30 組氨酸(L-Histidine Hydrochloride Monohydrate) 10 50異亮氨酸(L-Isoleucine) 20 60亮氨酸(L-Leucine) 30 70賴氨酸(Hydine hydrochloride) 50 150甲硫氨酸(L-Methionine) 10 30苯丙氨酸(L-Phenylalanine) 20 500. 1脯氨酸(L-Proline)絲氨酸(L-Serine)蘇氨酸(L-Threonine)色氨酸(X-TryptophMi)酪氨酸(X_Tyrosine Disodium Dihydrate)纈氨酸(L-Valine)生物素(D-Biotin)葉酸(Folic Acid)煙醯胺(Niacinamide)卩比卩多酉享(Pyridoxine Hydrochloride)硫胺素(Thiamine Hydrochloride)石t辛酸(Lipoic Acid)葡萄糖(D-Glucose)60000. 10. 10. 10. 10. 1丙嗣酸納(Sodium Pyruvate) 次黃嘌呤(Hypoxanthine) 胸苷(Thymidine)羥乙基哌嗪乙磺酸(Hydroxyethyl Piperazine Ethanesulfonic Acid) 膽固醇(Cholesterol)生育酚醋酸酯(DL-alpha-Tocopherol Acetate)豆蔻酸(Myristic Acid)棕櫚酸(Palmitic Acid)棕櫚油酸(Palmitoleic Acid)硬脂酸(Stearic Acid)吐溫80(Tween 80)轉鐵蛋白(Transferrin)白蛋白(Bovine Serum Albumin)胰島素(Insulin)亞硒酸鈉(Sodium Selenite)胰蛋白水解物(Lucaratone Tryptone USP)嵌段式聚醚F68(Pluronic F68)酚紅(Sodium Phenol Red)2 -一 3010 4010 605 -一 2030 7030 700. 0032 5 2 10 1 5 1 5 0. 1 0. 5 1000 50 150 2 10 0. 1 0. 8 1000 5000 1 5 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 0. 005 1 3. 15 30 20 300 5 50 50 150 1500 3000 0. 1 2000 5 10。全文摘要
本發明涉及現代生物技術之培養基研發技術領域，為一種適於MDCK細胞大規模貼壁培養和單細胞懸浮培養的無血清培養基，它包括21種胺基酸、6種維生素、8種鹽類、8種脂類、4種微量元素、2種緩衝劑、1種蛋白水解物、1種酸鹼指示劑以及6種其他添加物；該無血清培養基可採用常規的製備方法進行製取，其使用方法也為常規方法；本發明的積極效果為不含血清，組分明確，有利於產物的分離純化，提高產品品質；支持MDCK細胞長期傳代培養，無需長期而複雜的適應過程；能良好地支持MDCK細胞的貼壁生長和MDCK細胞的單細胞懸浮生長，組分明確、配製和使用容易，適於生物製品的大規模生產。
文檔編號C12N5/02GK101760442SQ20101002283
公開日2010年6月30日 申請日期2010年1月15日 優先權日2010年1月15日
發明者周燕, 譚文松, 趙亮, 黃錠 申請人:華東理工大學