一種白花蛇舌草有效組分及製備方法和應用的製作方法

2023-05-03 00:11:36 1

專利名稱：：一種白花蛇舌草有效組分及製備方法和應用的製作方法
技術領域：
：本發明屬中藥提取物，具體地說涉及從白花蛇舌草中提取的有效組分，及其製備方法，以及該有效組分在製備治療、預防腫瘤藥物中的應用。技術背景腫瘤是一種常見病、多發病，其中惡性腫瘤是目前危害人類健康最嚴重的一類疾病。目前業內對惡性腫瘤的治療主要還是以手術、放療、化療為主，但許多化學抗癌藥物在作用於靶細胞時往往累及正常細胞，造成嚴重的副反應。植物藥的遺傳毒性不明顯，中草藥在抗癌抗突變方面有獨特的優勢和廣闊的應用前景，而且中藥在對腫瘤的輔助治療中也起到不容忽視的作用。紫杉醇即是典型的從植物中獲得的具有良好抗癌活性的天然化合物，現已開發為抗腫瘤藥物。目前我國危害性最為嚴重的腫瘤為肺癌、鼻咽癌、食管癌、胃癌、大腸癌、肝癌、乳腺癌、宮頸癌、白血病及淋巴瘤等。特別是肝癌的發生率近年來有所增加。值得重視，這些腫瘤的病因學、發病學及其防治，均為我國腫瘤研究的重點。尋找高效低毒的抗癌藥物以及抗癌輔助藥物是當前腫瘤研究的重要內容。我國藥用生物資源十分豐富，其生理活性物質是研究和發現新藥先導化學物，開發新藥的天然寶庫。目前，我國從天然產物中提取活性物質，用於開發成治療腫瘤疾病、安全性好、毒性低的新藥還很少，從天然產物中提取活性物質，開發成具有抗腫瘤療效的新藥，具有重要應用價值和廣闊發展前景。白花蛇舌草01denlandiadiffusa(Willd)Roxb為茜草科植物白花蛇舌草的帶根全草，始載於《廣西中藥志》。其葉形似蛇舌，開白花，故名。別名蛇舌草，廣泛分布於長江流域及以南，主產福建、廣東、廣西等地。其性味苦、甘、寒，入心、肝、脾三經，功效清熱解毒，活血化瘀，消炎止痛。民間常用此草藥治療咽喉腫痛、蛇傷疔瘡、癌腫等，現代研究表明，白花蛇舌草具有增強非特異性免疫作用。白花蛇舌草的化學成分主要含有蒽醌類化合物、環烯醚苷萜類、甾醇類、烷烴類等成分。白花蛇舌草具有增強動物免疫功能的作用(秦鳳華，上海免疫學雜誌，1990，10(6):321-323)，對荷瘤小鼠免疫器官功能有顯著促進作用(許鳳雲等，河南中醫，1997，17(4):209-212)，本品提取物對肝癌細胞H印G2有明顯的增殖抑制作用(李玉祥等，中國藥科大學學報，1999，30(1):37-42)。此外，白花蛇舌草還具有保肝利膽、消炎抗菌等作用，在中樞神經系統可呈鎮靜、催眠、鎮痛作用。
發明內容本發明的目的是提供一種白花蛇舌草有效組分，該有效組分主要含有A(2-甲氧基-3-羥基蒽醌)，B(2-甲基-3-羥基蒽醌)兩種化合物，其中A的含量為5575%，B的含量為15~25%。優選A的含量為6070%，B的含量為17~23%最佳選A的含量為63~68%，B的含量為1921%。本發明中，A的結構式為formulaseeoriginaldocumentpage5本發明中，B的結構式為formulaseeoriginaldocumentpage5本發明的另一目的是提供該白花蛇舌草有效組分的製備方法，通過以下步驟實現將白花蛇舌草藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液n，將洗脫液n濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。優選的白花蛇舌草有效組分製備方法，包括下列步驟將白花蛇舌草藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.8-1.2小時，提取1~3次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為911ml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。最佳的白花蛇舌草有效組分製備方法，包括下列步驟將白花蛇舌草藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流l小時，提取2次，合併濾液得提取液；將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱(ZorbaxSB-C18;21.2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B)，梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為80%的水溶液、流動相B為20%的乙腈溶液；45分鐘時，流動相A為5%的水溶液、流動相B為95。/。的乙腈溶液；50分鐘時，流動相A為5%的水溶液、流動相B為95%的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫；樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段22.4~28.lmin收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。本發明的再一個目的是提供該白花蛇舌草有效組分在製備治療、預防腫瘤藥物中的應用。本發明的白花蛇舌草有效組分可以作為活性成分，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法製成製劑。本發明的白花蛇舌草有效組分還可以作為活性成分之一，還含有其他抗腫瘤藥物，加入藥劑學上接受的藥物賦形劑或載體，按照藥劑學上記載的方法製成製劑。所述藥物的製劑形式包括液體製劑、固體製劑、膠囊劑、膠丸劑。包括注射液、滴注液、粉針劑、顆粒劑、片劑、衝劑、散劑、口服液、糖衣片劑、薄膜衣片劑、腸溶衣片劑、膠囊劑、硬膠囊劑、軟膠囊劑、口含劑、顆粒劑、丸劑、膏劑、丹劑、噴霧劑、滴丸劑、崩解劑、口崩片、微丸等。本發明的有益效果為1.本發明的提取分離工藝中使用了正相矽膠柱，能有效地除去糖、蛋白質、胺基酸等雜質，提高有效成分的含量，同時採用了製備色譜，能快速準確的得到有效成分。2.本發明提供的白花蛇舌草有效組分化學成分簡單明確，在藥理研究上更易於闡明其作用機制，在生產中更易於藥物的質量控制。3.本發明提供的方法首次從白花蛇舌草中得到A、B等幾個成分的組合物，並首次將其在多種腫瘤細胞株上進行藥效篩選，得到較好的藥理活性。圖1為本發明白花蛇舌草有效組分的HPLC分析圖。圖2為本發明白花蛇舌草有效組分ELSD圖譜。具體實施方式本發明結合附圖和下面實施例進一步詳細說明本發明的實質內容，該實施例僅用於說明本發明而並非對本發明的限制。實施例一白花蛇舌草有效組分的製備將200g白花蛇舌草藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇，加熱提取得提取液，將提取液濃縮成浸膏21.6g，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品3.6g;用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫。樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段22.4~28.lmin收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分0.16g。實施例二白花蛇舌草有效組分的製備將500g白花蛇舌草藥材粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(1:0.81.2)，加熱回流0.8-1.2小時，提取1~3次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏41.8g，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(4753:1)作為流動相，得洗脫液I，棄之，然後改換氯仿和甲醇(813:1)作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液n濃縮乾燥後得樣品7.0g;用製備液相色譜繼續分離得到的樣品；製備色譜的分離條件色譜柱為製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9~llml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段22.428.1min收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分0.30g。實施例三白花蛇舌草有效組分的製備取白花蛇舌草藥材250g，將其粉碎後加入乙酸乙酯和乙醇(l:l)，加熱回流1小時，提取2次，濾液合併得提取液。將提取液濃縮成浸膏得23.2g，將浸膏和矽膠拌樣，用正相矽膠柱進行分離，首先用石油醚和乙酸乙酯(50:1)作為流動相，得洗脫液I，然後改換氯仿和甲醇(10:1)作為流動相，得洗脫液II，濃縮乾燥後得3.9g樣品。用製備液相色譜繼續分離得到的樣品。製備色譜的分離條件色譜柱為Agient製備柱(ZorbaxSB-C18;2L2mmx250mm)，流動相為水(A)和乙腈(B),梯度洗脫程序如下O分鐘時，流動相A為80%的水溶液、流動相B為20。/。的乙腈溶液；45分鐘時，流動相A為5。/。的水溶液、流動相B為95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相A為5。/。的水溶液、流動相B為95。/。的乙腈溶液；流速為10ml/min，柱溫為室溫。樣品用100%乙醇溶解，經製備液相色譜分離，在時間段22.4~28.lmin收集溶液，濃縮乾燥後得到有效組分0.18g。實施例四白花蛇舌草有效組分HPLC-ELSD指紋圖譜色譜條件色譜柱AgilentZorbaxSB-C18柱(4.6mmx150mm，5pm);採用梯度洗脫，流動相A相為0.2%冰醋酸水溶液，流動相B相為含0.2%冰醋酸的乙腈溶液；梯度洗脫程序如下0分鐘時，流動相A為卯％的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為10%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；10分鐘時，流動相A為50%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為50%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；30分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95%的0.2%冰醋酸的乙腈溶液；35分鐘時，流動相A為5%的0.2%冰醋酸水溶液、流動相B為95°/。的0.2%冰醋酸的乙腈。溶液流速0.5mL'min";檢測波長全波長；柱溫3(TC。ELSD參數氮氣流速2.0L/min;漂移管溫度105°C。供試品溶液的製備稱取本品，用甲醇溶液溶解在容量瓶中，稀釋至刻度，搖勻，即得。測定方法精密吸取供試品溶液，注入液相色譜儀，依色譜分析條件測定，即得。分析結果白花蛇舌草有效組分的HPLC-ELSD分析譜圖見圖1和圖2，兩圖中的l、2、號峰，分別是A、B。兩個峰的相對保留時間依次為16.7(A)，17.4(B)o本發明中，A的結構式為:formulaseeoriginaldocumentpage9本發明中，B的結構式為:實施例五白花蛇舌草有效組分製劑取實施例三的白花蛇舌草有效組分0.5g與10.5g聚乙二醇-6000混合均勻，加熱熔融，化料後移至滴丸滴灌中，藥液滴至68"C液體石蠟中，除油，製得滴丸400粒。實施例六白花蛇舌草有效組分製劑取實施例三的白花蛇舌草有效組分0.5g、葡萄糖4.5g、硫代硫酸鈉0.9g和蒸餾水lml，上述組分混合均勻後，冷凍乾燥，分裝500支，即得。實施例七白花蛇舌草有效組分製劑取降香油1.5g，加入到13ml飽和的羥丙基e-環糊精中，攪拌溶解，濾過，濾葉低溫乾燥，的降香油和羥丙基e-環糊精的包合物粉末。除上述降香油合羥丙基e-環糊精的包合物粉末外，再取實施例三的白花蛇舌草提取物0.5g、甘露醇5.5g、依地酸鈣鈉0.9g和蒸餾水2ml，上述組分混勻後，冷凍乾燥，分裝300支，即得。實施例八白花蛇舌草有效組分的藥理實驗藥理模型HL60腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用RPMI1640(Gibco)藤加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，胎牛血清(四季青)10%，非必需胺基酸(Gibco)1%混合培養HL60細胞，密度需低於1Q6個/mL。計算需要細胞總量NT=pcel卜mL—、VT(p=2"04個/mL)，其中V產0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10ijL，加10ML胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NJ4x10、2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液、mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-Nt/Nx、。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100ijL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入100nLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案白花蛇舌草有效組分用DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150iJL。在新的96孔板中加入220mL/孔的培養液，將吸取0.88iJL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50pL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設4個平行復孔，每板設空白組(blank,只加培養液，不含細胞)，及陰性對照組(negative,細胞中加入空白溶液，空白溶液配法一加入200iJL的培養液，將吸取0.88IJLDMSO加入混勻)。SRB染色細胞培養結束後，取出培養板，每孔加入40。/。(質量/體積)的三氯乙酸(TCA)100yL固定細胞，室溫放置5min，4'C冰箱中放置1h。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中乾燥後，每孔加0.4。/。的SRB100"L(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內液體後用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中乾燥後用10mmol/LTris150yL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組逾一空白組難x100%陰性對照組^值一空白組力值藥效結果見表l。根據HL60腫瘤細胞抑制率結果，白花蛇舌草有效組分對抑制HL60腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。tableseeoriginaldocumentpage112.2藥理模型K562腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用RPMI1640(Gibco)[添加2g/L碳酸氫鈉]90%,小牛血清(賽樂)10%，非必需胺基酸(Gibco)1。/。混合培養K562細胞。計算需要細胞總量NT-pcellTnL-lxVT(p-8x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10^iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入10(HiL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入10(^LPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案白花蛇舌草有效組分加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入5(HiL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4pg/mL)。SRB染色細胞培養結束後，取出培養板，每孔加入40%(質量/體積)的三氯乙酸(TCA)70uL固定細胞，4。C冰箱中放置lh。培養板各孔用去離子水洗滌5遍，以去除TCA。在空氣中乾燥後，每孔加0.4。/。的SRB100uL(1%色譜純乙酸溶解)，室溫下放置20min，棄去各孔內液體後用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中乾燥後用lOmmol/LTrisl50uL/孔溶解，振蕩5min，使用酶標儀(ELx800)測定，所用波長為490nm。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組應-空白組應x100%陰性對照組力值一空白組^(值藥效結果見表2。根據K562腫瘤細胞抑制率結果，白花蛇舌草有效組分對抑制K562腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表2tableseeoriginaldocumentpage122.3藥理模型MCF-7腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需胺基酸(Gibco)1。/。混合培養MCF-7細胞。計算需要細胞總量NT-pcelhmL-lxVT(p二2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取l(^L，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2:NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，乘IJ餘孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案白花蛇舌草有效組分根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150^L。在新的96孔板中加入220pL/孔的培養液，將吸取0.88pL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入5(^L，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pig/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去處每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100nL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150pL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=細應-空白歸x100%陰性對照組^值一空白組/<值藥效結果見表3。根據MCF-7腫瘤細胞抑制率結果，白花蛇舌草有效組分對抑制MCF-7腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表3tableseeoriginaldocumentpage13細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]90%，小牛血清(賽樂)10%，非必需胺基酸(Gibco)1%混合培養KB細胞。計算需要細胞總量NT二pcell，mL-lxVT(p二2x103個/mL)，其中VT=0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10^iL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液V1mL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2=NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100pL，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入100iiLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案白花蛇舌草有效組分根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液15(HiL。在新的96孔板中加入220)iL/孔的培養液，將吸取0.88jiL藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入5(^L，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50pg/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200mL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去處每孔上清，加入培養液一MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100fiL，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150pL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx,)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物射值一空白組難x100%陰性對照組力值一空白組^值藥效結果見表4。根據KB腫瘤細胞抑制率結果，白花蛇舌草有效組分對抑制KB腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表4tableseeoriginaldocumentpage142.5藥理模型HepG2腫瘤細胞細胞培養與種板細胞培養使用DMEM高糖型(Gibco)[添加3.7g/L碳酸氫鈉]^)%，胎牛血清(四季青)10%，非必需胺基酸(Gibco)1%混合培養HepG2細胞。計算需要細胞總量NT二pcell'mL-lxVT(p二2xl03個/mL)，其中VT-0.1mLx孔數+細胞槽剩餘量。吹打培養瓶壁上的懸浮細胞，加入離心管中。取10pL，加10pL胎盤藍稀釋，計算計數板上活細胞數總數NL，則離心管中的細胞數N為NL/4xl04x2xV個，其中V為離心前離心管中的溶液體積。離心(900rad/min，10min)，吸去上清液，加入培養液VlmL，吹打，使細胞混勻，吸取V2mL加入到細胞槽中，使V2-NT/NxVl。在細胞槽中再加入VT-V2mL的培養液，用排槍吹打、混勻，取該液，每孔加入100^L，孵育24h。種板後選取4孔加入培養液作為空白對照，剩餘孔加入100pLPBS，以減少培養液的蒸發。給藥方案白花蛇舌草有效組分根據所稱量的藥品的重量，根據所稱量的藥品的重量，加入相應體積的DMSO溶解，濃度為約50mg/mL。震蕩溶解，若有大量液滴粘壁，可適當離心。可儲存-20。C。96孔板換液，每孔加入新鮮培養液150pL。在新的96孔板中加入220)iL/孔的培養液，將吸取0.88^L藥液加入混勻，稀釋250倍，將上述稀釋好的藥物向種有細胞的孔每孔加入50^iL，此時藥物稀釋1000倍，即終濃度為50ng/mL。孵育48h。每個濃度設4(2)個平行復孔，每板設陰性對照組(細胞中加入空白溶液，空白溶液配法——加入200pL的培養液，將吸取0.88pLDMSO加入混勻)，陽性對照組(阿黴素終濃度4pg/mL)。MTT比色法測定取出培養板，去處每孔上清，加入培養液—MTT混合溶液(培養液MTT溶液二10:1)100^L，孵育4h。吸棄培養液，每孔加入150jiL的DMSO，振蕩10min，550nm酶標儀(Elx800)測定。抑制率的計算抑制率按如下公式計算抑制率(％)=藥物組力值-空白組^值x1QQ%陰性對照組^值一空白組」值藥效結果見表5。根據HepG2腫瘤細胞抑制率結果，白花蛇舌草有效組分對抑制HepG2腫瘤細胞增殖有非常顯著效果。表5tableseeoriginaldocumentpage15權利要求1.一種白花蛇舌草有效組分，其特徵是該有效組分含有化合物A2-甲氧基-3-羥基蒽醌和化合物B2-甲基-3-羥基蒽醌，其中化合物A的含量為55～75％，化合物B的含量為15～25％，A的結構式為B的結構式為2.根據權利要求1所述的一種白花蛇舌草有效組分的製備方法，其特徵是通過以下步驟實現將白花蛇舌草藥材粉碎後加入1:0.8L2的乙酸乙酯和乙醇，加熱回流0.81.2小時，提取13次，合併濾液得提取液，將提取液濃縮成浸膏，並將其與矽膠進行拌樣，用正相矽膠柱對其進行分離，首先用47~53:1的石油醚和乙酸乙酯作為流動相，得洗脫液I，棄之，再用813:1的氯仿和甲醇作為流動相，得洗脫液II，將洗脫液II濃縮乾燥後得樣品；用製備液相色譜繼續分離得到的目的物；製備色譜的分離條件為色譜柱為製備柱，流動相為水和乙腈，梯度洗脫，流速為9llml/min，柱溫為室溫，收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。3.根據權利要求2所述的一種白花蛇舌草有效組分的製備方法，其特徵是所述梯度洗脫程序為O分鐘時，流動相為80%的水溶液和20%的乙腈溶液；45分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液；50分鐘時，流動相為5%的水溶液和95%的乙腈溶液。4.根據權利要求2所述的一種白花蛇舌草有效組分的製備方法，其特徵是色譜分離後，在22.428.1min時間段收集溶液。5.根據權利要求1所述的一種白花蛇舌草有效組分在製備治療、預防腫瘤藥物中的應用。6.根據權利要求5所述的一種白花蛇舌草有效組分的應用，其特徵是-所製備的藥物還含有製劑允許的藥物賦形劑或載體。7.根據權利要求5所述的一種白花蛇舌草有效組分的應用，其特徵是所製備的藥物還含有其他抗腫瘤藥物。8.根據權利要求5所述的一種白花蛇舌草有效組分的應用，其特徵是所述藥物的製劑形式包括液體製劑、固體製劑、膠囊劑、膠丸劑。9.根據權利要求8所述的一種白花蛇舌草有效組分的應用，其特徵是-所述藥物的給藥方式包括口服給藥、注射給藥。全文摘要本發明提供一種白花蛇舌草有效組分，主要含有2-甲氧基-3-羥基蒽醌(A)和2-甲基-3-羥基蒽醌(B)兩種化合物，其中A的含量為55～75％，B的含量為15～25％。通過加熱提取，濃縮，矽膠柱分離，洗脫，洗脫液濃縮乾燥，再用液相色譜繼續分離，收集溶液，溶液經濃縮乾燥後得到有效組分。本發明提供的白花蛇舌草有效組分可在製備治療、預防腫瘤藥物中的應用。本發明方法設計合理，能快速準確的得到有效成分，在生產中更易於藥物的質量控制。文檔編號A61K45/06GK101129521SQ20071007127公開日2008年2月27日申請日期2007年9月11日優先權日2007年9月11日發明者靂劉,強史,水文波,瞿海斌,程翼宇,靜竇,葛志偉,慶賀申請人:浙江大學