Dig-5殺蟲cry毒素的製作方法

2023-05-03 04:55:26 1

專利名稱：Dig-5殺蟲cry毒素的製作方法
技術領域：
本發明關注新的殺蟲Cry毒素及其控制昆蟲的用途。
背景技術：
蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis, B. t.)是一種土壤傳播的細菌，其生成稱作德爾塔內毒素或Cry蛋白的殺蟲晶體蛋白。Cry蛋白是通過作用於易感昆蟲的中腸細胞來發揮功能的口服毒藥。已經顯示了一勝Cry毒素具有針對線蟲的活件。htto //www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil Crickmore/Bt/intro. html 處維護和定期更新德爾塔內毒素的廣泛列表。西方玉米根蟲 / 玉米根螢葉甲(Western corn rootworm, WCR, Diabrotica virgifera virgifera LeConte)，是一種在經濟上重要的玉米害蟲，由於作物產量損失和昆蟲管理支出，其在北美洲每年引起估計10億美元收入損失(Metcalf，1986)。WCR管理實踐包括與大豆的輪作、化學殺蟲劑和新進的表達B. t. Cry蛋白的轉基因作物。然而，至今只有少數B. t. Cry蛋白實例提供商業水平的針對WCR的功效，包括Cry34Abl/Cry35Abl (Ellis 等，2002)、經修飾 Cry3Aal (Walters 等，2008)和經修飾 CryiBBbl (Vaughn 等，2005)。這些 B. t.蛋白在轉基因玉米的根中生成時高度有效地防止WCR玉米根損傷(Moellenbeck等， 2001 ；Vaughn 等，2005 ；美國專利 No. 7361813)。雖然WCR抗性轉基因玉米獲得了成功，但是數個因素產生了發現和開發新的Cry 蛋白來控制WCR的需要。第一，儘管轉基因玉米植物中當前採用的Cry蛋白的生成針對WCR 根損傷提供有力的保護，由此保護穀物產量，但是在人工侵襲試驗中出現了一些WCR成蟲， 指示昆蟲幼蟲控制不夠完全。第二，抗性昆蟲群體的發生威脅Cry蛋白在根蟲控制中的長期耐久性。已經在田地了發生了小菜蛾(Plutella xylostella) (Tabashnik，1994)、粉紋夜蛾(Trichoplusia ni) (Janmaat 和 Myers，2003，2005)、和谷實夜蛾(Helicoverpa zea) (Tabashnik等，2008)的對Cry蛋白有抗性的鱗翅類昆蟲。可經由數種機制發生對B. t. Cry 蛋白有抗性的昆蟲(Heckel等，2007 ;Pigott和Ellar，2007)。已經在昆蟲內鑑定了 Cry蛋白的多個受體蛋白類別，而且每個受體類別內存在多個實例。例如可以依靠受體蛋白的鈣粘蛋白域的毒素結合部分內的突變發生對特定Cry蛋白的抗性。抗性的另一種手段可以經由原毒素加工蛋白酶介導。鱗翅目物種中對Cry毒素的抗性具有複雜的遺傳基礎，有至少四種不同的主要的抗性基因。類似地，預測多種基因控制鞘翅目物種中對Cry毒素的抗性。 開發新的高效力Cry蛋白會為WCR管理提供額外的工具。可以在轉基因玉米中組合生成具有不同作用模式的Cry蛋白來防止發生WCR昆蟲抗性和保護B. t.技術用於根蟲控制的長期效用。發明概述
本發明提供殺蟲Cry毒素(包括本文中稱作DIG-5的毒素以及DIG-5的變體)、編碼這些毒素的核酸、使用該等毒素控制害蟲的方法、在轉基因宿主細胞中生成該等毒素的方法、和表達該等毒素的轉基因植物。SEQ ID N0:2給出野生型DIG-5毒素的預測胺基酸序列。如實施例1中描述的，自Dow AgroSciences LLC內部稱作PS198Q7的B. t.菌株分離了編碼DIG-5蛋白的核酸。測定了全長編碼區的核酸序列，並自該核酸序列推導了全長蛋白質序列。DIG-5毒素與Cry7Bal (Genbank登錄號ABB70817. 1)和其它蘇雲金芽孢桿菌 Cry7 型蛋白(http://www. lifesci. sussex. ac. uk/home/Neil_Crickmore/Bt/intro. html)具有一些相似性。本文中還描述DIG-5毒素的殺蟲活性變體，而且統稱為DIG-5毒素。毒素可以單獨使用，或者與其它Cry毒素組合使用，諸如Cry34Abl/ Cry35Abl (DAS-59122-7)、Cry3Bbl (M0N88017)、Cry3A(MIR604)、嵌合 CrylAb/Cry3Aa(FR8A, WO 2008/121633A1)、CryET33 和 CryET34、ViplA、Crylla、CryET84、CryET80、CryET76、 CryET71、CryET69、CryET75、CryET39、CryET79、和 CryET74，來控制發生抗性鞘翅類昆蟲群體。DIG-5毒素也可以與RNAi方法組合使用，來控制其它昆蟲害蟲。例如，DIG-5可以與用於阻抑玉米根蟲中的必需基因或昆蟲害蟲中的必需基因的dsRNA組合用於轉基因植物。此類靶基因包括例如液泡ATP酶、ARF-l、Act42A、CHD3、EF-la、和TFIIB。合適靶基因的一個實例是液泡ATP酶，如W02007/035650中披露的。在一個實施方案中，本發明提供一種分離的DIG-5毒素多肽，其包含選自下組的核心毒素區段(a)包含SEQ ID NO 2殘基114至655的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO :2殘基114至655的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO :2殘基114至655的胺基酸序列及多至20個基酸的對由SEQ ID NO 2編碼的毒素的表達或活性沒有不利影響的替代、刪除、或修飾的多肽；或其殺蟲活性片段。在另一個實施方案中，本發明提供一種分離的DIG-5毒素多肽，其包含選自下組的DIG-5核心毒素區段(a)包含SEQ ID NO 2殘基1至655的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO :2殘基1至655的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列多肽；(c)包含SEQ ID NO :2殘基1至655的胺基酸序列及多至20個胺基酸的對由SEQ ID NO 2編碼的毒素的表達或活性沒有不利影響的替代、刪除、或修飾的多肽；或其殺蟲活性片段。在另一個實施方案中，本發明提供一種分離的DIG-5毒素多肽，其包含選自下組的DIG-5核心毒素區段(a)包含SEQ ID NO 2殘基114至1149的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO 2殘基114至1149的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO 2殘基114至1149的胺基酸序列及多至20個胺基酸的對由 SEQ ID NO :2編碼的毒素的表達或活性沒有不利影響的替代、刪除、或修飾的多肽；或其殺蟲活性片段。在另一個實施方案中，本發明提供一種分離的DIG-5毒素多肽，其包含選自下組的的DIG-5核心毒素區段(a)包含SEQ ID NO 2殘基1至1149的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQ ID NO 2殘基1至1149的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQ ID NO :2殘基1至1149的胺基酸序列及多至20個胺基酸的對由SEQ ID NO 2編碼的毒素的表達或活性沒有不利影響的替代、刪除、或修飾的多肽；或其殺蟲活性片段。在另一個實施方案中，本發明提供一種植物，其包含DIG-5毒素。在另一個實施方案中，本發明提供一種用於控制害蟲群體的方法，其包括使所述群體與殺蟲有效量的DIG-5毒素接觸。在另一個實施方案中，本發明提供一種分離的核酸，其編碼DIG-5毒素。在另一個實施方案中，本發明提供一種DNA構建體，其包含可操作連接至啟動子的編碼DIG-5毒素的核苷酸序列，該啟動子不是自蘇雲金芽孢桿菌衍生的且能夠在植物中驅動表達。本發明還提供一種轉基因植物，其包含穩定摻入其基因組中的DNA構建體和一種用於針對害蟲保護植物的方法，其包括將該構建體導入所述植物中。序列簡述SEQ ID NO 1 編碼全長 DIG-5 毒素的 DNA 序列；3447nt。SEQ ID NO 2 全長 DIG-5 蛋白序列；1149aa。SEQ ID NO 3經玉蜀黍優化的DIG-5核心毒素編碼區；1965nt。SEQ ID NO :4CrylAb 原毒素區段；545aa。SEQ ID NO 5 嵌合毒素DIG_5 核心 /CrylAb 原毒素區段；1200aa。SEQ ID NO 6經雙子葉優化的編碼CrylAb原毒素區段的DNA序列；1635ntSEQ ID NO 7經玉蜀黍優化的編碼CrylAb原毒素區段的DNA序列；1635nt發明詳述DIG-5毒素，和殺蟲活性變體。在SEQ ID NO 2的全長DIG-5毒素之外，本發明涵蓋殺蟲活性變體。通過術語「變體」，申請人意圖包括片段、某些刪除和插入突變體、和某些融合蛋白。DIG-5是一種經典的三域Cry毒素。作為描述本發明中包括的DIG-5毒素變體的前言，簡要回顧一般的三域Cry毒素和特殊的DIG-5蛋白毒素的結構會是有益的。大多數蘇雲金芽孢桿菌德爾塔-內毒素晶體蛋白分子由兩個功能性區段構成。 蛋白酶抗性核心毒素是第一個區段，而且對應於該蛋白質分子的大約前一半。完整的 130kDa原毒素分子被昆蟲腸中的蛋白酶快速加工成抗性核心區段。被此加工刪除的區段在本文中稱作「原毒素區段」。認為原毒素區段參與毒素晶體形成(Arvidson等，1989)。通過降低蛋白酶對毒素分子的加工(Haider等，1986)或通過降低毒素溶解度(Aronson等， 1991)，原毒素區段可能如此通過限制核心對昆蟲的可及性而賦予毒素以部分昆蟲特異性。即使在某一個類別內，B. t.毒素在長度方面和在核心毒素部分至原毒素部分的過渡的精確位置方面有一定程度的變化。核心毒素部分至原毒素部分的過渡通常會位於全長毒素的約 50%至約60%之間。SEQ ID NO :2公開全長DIG-5多肽1149個胺基酸的序列，其中N端 655個胺基酸構成DIG-5核心毒素。SEQ ID N0:1的5'端1965個核苷酸包含核心毒素的編碼區。已經為 CrylAal、Cry2AaU Cry3AaU Cry3BbU Cry4Aa, Cry4Ba 和 Cry8Eal 測定了三維晶體結構。核心毒素的這些結構非常相似，而且由具有下文所述特徵的三個不同域構成(綜述見de Maagd等，2003)。域I是一束七個α螺旋，其中螺旋5被六個兼性螺旋包圍。此域涉及孔形成，而且與其它孔形成蛋白共享結構相似性，包括溶血素和大腸桿菌素。DIG-5蛋白的域I包含 SEQ ID NO 2的胺基酸殘基55至觀1。域II由在β柱中填充到一起的三個反向平行的β片層形成。此域的環在結合昆蟲中腸受體中發揮重要作用。在CrylA蛋白中，在域II β片層的頂點處表面暴露的環涉及結合鱗翅類鈣粘蛋白受體。Cry3Aa域II環以相似方式結合馬鈴薯葉甲/科羅拉多馬鈴薯甲蟲(Leptinotarsa decemlineata Say, Colorado potato beetle)的膜結合金屬蛋白酶(Ochoa-Campuzano等，2007)。域II與某些碳水化合物結合蛋白共享結構相似性，包括卵黃磷蛋白(vitelline)和榴槤凝素(jacaline)。DIG-5蛋白的域II包含SEQ ID NO 2 的胺基酸殘基286至499。域III是兩個反向平行的β片層的β三明治。在結構上，此域涉及諸如葡聚糖酶、半乳糖氧化酶、唾液酸酶等蛋白質的碳水化合物結合域。域III結合某些類別的受體蛋白，而且可能參與與第二類別的受體相互作用的寡聚毒素前孔的插入，在CrylA蛋白的情況中，實例有氨肽酶和鹼性磷酸酶(Hon6e等，1991 ；Pigott和Ellar，2007)。鞘翅目中的類似Cry域III受體仍有待鑑定。保守的B. t.序列段2和3分別位於域II的N端和C 端附近。因此，這些保守的序列段2和3是三個功能域之間的大致邊界區。已經為工程化重組B.t.毒素開發了這些具有保守DNA和蛋白質同源性的區(美國專利No. 6，090，931 ； W091/01087 ；WO 95/06730 ；WO 1998022595)。DIG-5 蛋白的域 III 包含 SEQ ID NO :2 的胺基酸殘基509至653。已經報告了域I的α-螺旋1在受體結合後被消除。Aronson等(1999)證明了結合至BBMV的CrylAc受到保護免於剛好在α -螺旋1後面的殘基59處開始的蛋白酶K切割； 為CrylAb引用了相似的結果。Gomez等^)02)發現了在BBMV受體結合時形成的CrylAb 寡聚體缺少域I的α -螺旋1部分。還有，Soberon等Q007)顯示了 CrylAb和CrylAc的缺少在三維Cry結構上涵蓋α -螺旋1的大約60個胺基酸的N端刪除突變體能夠在鈣粘蛋白結合缺失下將分子量約60kDa的單體裝配成前孔。報告了這些N端刪除突變體對Cry 抗性昆蟲幼蟲有活性。另外，Diaz-Mendoza等Q007)記載了保留對地中海玉米蛀蟲/蛀 ^ ! (Mediterranean corn borer, Sesamia nonagrioides)白勺 舌f生白勺 43kDa 禾口 46kDa 的CrylAb片段。證明了這些片段包括胺基酸殘基116至423 ；然而，沒有闡明精確胺基酸序列，而且這些蛋白水解片段的活性的機制未知。Gomez等Q002) ；Soberon等Q007)；及 Diaz-Mendoza等Q007)的結果與Hofte等(1986)報告的自CrylAb的N端刪除36個胺基酸導致殺蟲活性喪失的結果形成對比。
通過比較DIG-5蛋白序列與結構已知的Cry8Eal蛋白序列，我們已經推導了 DIG-5 毒素的域I中螺旋1、2A、2B、和3的起點和終點，及它們之間的間隔區的位置。表1中描述這些位置。表1。DIG-5蛋白凸出的α -螺旋的胺基酸坐標。
-__螺旋1 間隔螺旋2Α 間隔螺旋2Β 間隔螺旋3 間隔螺旋4
SEQ ID NO: 2
50-68 69-74 75-89 90-98 99-108 109-113 114-143 144-147 148-168 的殘基________DIG-5的氨基端刪除變體。在一個方面,本發明提供DIG-5變體，其中刪除整個或部分螺旋1、2A、和2B以改善殺蟲活性和避免昆蟲發生抗性。進行這些修飾來提供具有改善的屬性的DIG-5變體，諸如改善的靶害蟲譜、效力、和昆蟲抗性管理。在本發明的一些實施方案中，主題修飾可影響導致昆蟲中毒的原毒素活化和孔形成的效率。更具體地，為了提供具有改善的屬性的DIG-5變體，描述了消除基因編碼N端的部分的逐步刪除。刪除消除域 I中整個α -螺旋1和整個或部分α -螺旋2，而維持α -螺旋3至7的結構完整性。本發明因此部分涉及通過為更有效的孔形成改造域I的α -螺旋構件而實現的Cry蛋白功效的改善。更具體地，本發明部分涉及改良DIG-5蛋白，其設計成在與Cryl蛋白域I中α-螺旋1和2具有推定二級結構同源性的區域中具有N端刪除。為了改善DIG-5毒素的殺蟲特性的刪除可以在預測的α-螺旋2Α起點之前開始， 並在α -螺旋2Β終點之後結束，但是優選不延伸入α -螺旋3中。在設計N端刪除變體的編碼序列時，在為了表達刪除變體設計的核苷酸序列的5』 端處插入編碼甲硫氨酸的ATG起始密碼子。對於為了在轉基因植物中使用設計的序列，遵守Varshavsky (1997)的「N端規則」可能是有益的。教導了一些胺基酸在作為蛋白質的N 端殘基展示時可能促進蛋白質在真核細胞中的降解和不穩定性。例如，自酵母和哺乳動物細胞中的觀察結果收集的數據指示N端失穩性胺基酸為F、L、W、Y、R、K、H、I、N、Q、D、E和可能的P。雖然蛋白質降解機制的細節在生物間可以有一些不同，但是上文看到的N端失穩性胺基酸的身份的保守性提示類似機制可能在植物細胞中發揮功能。例如，Worley等(1998) 發現了在植物中，N端規則包括鹼性和芳香族殘基。有可能植物蛋白酶在主題B. t.殺蟲蛋白α-螺旋3起點附近的蛋白水解切割可能暴露失穩性N端胺基酸。此類加工可將經過切割的蛋白質靶向快速衰變和限制B. t.殺蟲蛋白積累至不足以實現有效昆蟲控制的水平。 因而，對於以一個失穩性胺基酸開始的N端刪除變體，申請人更喜歡在翻譯起始甲硫氨酸和失穩性胺基酸之間添加規定G(甘氨酸)胺基酸的密碼子。實施例2給出依照本發明的DIG-5氨基端刪除變體的具體實例。嵌合毒素。先前R經報告了利用融合至一種Cry毒素之原毒素區段的另一種Cry 毒素之核心毒素域的嵌合蛋白。DIG-5變體包括如下的毒素，其包含DIG-5毒素的N端毒素核心部分(其可以是全長或具有上文所述N端刪除)，在核心毒素部分終點後的某點處融合至異源原毒素區段。對異源原毒素區段的過渡可以位於大約核心毒素/原毒素接點，或者， 可以保留部分天然原毒素(核心毒素部分後的延伸)，對異源原毒素的過渡位於下遊。例如，本發明的嵌合毒素具有DIG-5的整個毒素部分(胺基酸1-65 和異源原毒素(胺基酸656至C端)。在一個優選實施方案中，原毒素的異源部分是自CrylAb德爾塔-內毒素衍生的，如SEQ ID NO 5中例示的。SEQ ID NO :4公開在本發明的DIG-5變體中有用的CrylAb原毒素區段545個胺基酸的序列。注意此原毒素區段最後約100至150個胺基酸，最關鍵的是在本發明的嵌合毒素中包括它們。昆蟲腸蛋白酶通常發揮幫助昆蟲自食物蛋白質獲得所需胺基酸的功能。了解最多的昆蟲消化蛋白酶是絲氨酸蛋白酶，其表現為最常見的類型 (Englemarm和Geraerts，1980)，特別是在鱗翅類物種中。鞘翅類昆蟲具有比鱗翅類腸更加中性至酸性的腸。大多數鞘翅類幼蟲和成蟲，例如科羅拉多馬鈴薯甲蟲，具有略微酸性的中腸，而且半胱氨酸蛋白酶提供主要蛋白水解活性(Wolfson和Murdock，1990)。更精確地， Thie和Houseman (1990)鑑定和表徵了科羅拉多馬鈴薯甲蟲中的半胱氨酸蛋白酶，B樣組織蛋白酶和H樣組織蛋白酶，及天冬氨醯蛋白酶，D樣組織蛋白酶。Gillikin等(199 表徵了西方玉米根蟲幼蟲的腸中的蛋白水解活性，而且主要發現了半胱氨酸蛋白酶。美國專利 No. 7230167披露了西方玉米根蟲中存在的絲氨酸蛋白酶，組織蛋白酶G。昆蟲腸蛋白酶的多樣性和不同活性水平可影響昆蟲對特定B. t.毒素的敏感性。在本發明的另一個實施方案中，可以在期望位置處改造蛋白酶切割位點以影響某些昆蟲害蟲的易感幼蟲的中腸內的蛋白質加工。可以通過諸如化學基因合成或剪接交疊PCROtorton等，1989)等方法引入這些蛋白酶切割位點。例如可以任選在Cry蛋白結構中的特定位點處插入絲氨酸蛋白酶識別序列以影響易感幼蟲的中腸內的期望刪除點處的蛋白質加工。可以以此類方式利用的絲氨酸蛋白酶包括鱗翅類中腸絲氨酸蛋白酶諸如胰蛋白酶或胰蛋白酶樣酶、糜蛋白酶、彈性蛋白酶、等(Christeller等，199 。另外，可以改造通過對用未分級幼蟲中腸蛋白酶製備物生成的Cry蛋白消化產物測序或通過結合至刷狀緣膜囊憑經驗鑑定的刪除位點以實現蛋白質活化。通過基因刪除或通過引入蛋白酶切割位點任一生成的經修飾Cry蛋白具有改善的對鱗翅類害蟲諸如歐洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)(Diatraea grandiosella)(Helicoverpa zea)
虎(Agrotis ipsilon)、草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)、舌甘菜貪夜蛾(Spodoptera exigua)、小蔴杆草螟(Diatraea saccharalis)、豆白緣切根蟲(Loxagrotis albicosta)， 鞘翅類害蟲諸如西方玉米根蟲、南方玉米根蟲、北方玉米根蟲(即葉甲(Diabrotica spp.))和其它靶害蟲的活性。通過在期望加工位點處改造適宜識別序列，可以進一步利用鞘翅類絲氨酸蛋白酶諸如胰蛋白酶、糜蛋白酶和組織蛋白酶G樣蛋白酶，鞘翅類半胱氨酸蛋白酶諸如組織蛋白酶(B樣、L樣、0樣、和K樣蛋白酶)(Koiwa等，2000 ；及Bown等，2004)，鞘翅類金屬蛋白酶諸如ADAMlO (Ochoa-Campuzano等，2007)，和鞘翅類天冬氨酸蛋白酶諸如組織蛋白酶D樣和 E樣、胃蛋白酶、plasm印sin、和凝乳酶以影響某些昆蟲害蟲的易感幼蟲的中腸內的Cry蛋白加工。引入此類蛋白酶切割位點的一個優選位置可以在α -螺旋2Β和α -螺旋3之間的「間隔」區內，例如在全長DIG-5蛋白(SEQ ID NO :2和表1)的胺基酸109至113內。引入蛋白酶切割位點的第二個優選位置可以在α-螺旋3和α-螺旋4(表1)之間的間隔區內，例如在SEQ ID Ν0:2的全長DIG-5蛋白的胺基酸144至147內。通過基因刪除或通過引入蛋白酶切割位點任一生成的經修飾Cry蛋白具有改善的對昆蟲害蟲包括但不限於西方玉米根蟲、南方玉米根蟲、北方玉米根蟲、等等的活性。存在多種能夠測定包含多肽N端或C端殘基的胺基酸序列的技術。例如，可以以連續方式使用自動化Edman降解法以測定多至30個胺基酸殘基的N端胺基酸序列，每個殘基的準確度為98%。另外，測定包含多肽羧基端的胺基酸序列也是可能的(Bailey等，1992; 美國專利No. 6046053)。如此，在一些實施方案中，可以表徵依靠蛋白水解加工(例如通過自昆蟲的腸製備的蛋白酶)活化的B. t. Cry蛋白，並鑑定活化的毒素片段的N端或C端胺基酸。為了容許或消除昆蟲、植物或微生物蛋白酶對較大變體蛋白的蛋白水解切割通過在編碼序列中的適宜位置處引入或消除蛋白酶加工位點生成的DIG-5變體在本發明的範圍內。 理解，此類操作的最終結果是生成具有與完整(全長)毒素蛋白相同或更好的活性的毒素片段分子。DIG-5毒素的域。預期DIG-5毒素的各個域(及與此類域90、95、或97%相同的變體)可用於與來自其它Cry毒素的域形成組合以提供具有增大的害蟲毒性譜、改善的效力、或升高的蛋白質穩定性的新毒素。DIG-5蛋白的域I包含SEQ ID NO 2胺基酸殘基55 至沘1。DIG-5蛋白的域II包含SEQ ID NO 2胺基酸殘基286至499。DIG-5蛋白的域III 包含SEQ ID NO :2胺基酸殘基509至653。域交換或穿梭是用於生成改變的德爾塔-內毒素蛋白的另一種機制。域II和III可以在德爾塔-內毒素蛋白之間交換，產生具有改善的殺蟲活性或靶譜的雜合或嵌合毒素。域II涉及受體結合，而域III結合某些類別的受體蛋白且可能參與插入寡聚毒素前孔。已經顯示了其它毒素中的一些域III替代生成優異的針對貪夜蛾(Spodoptera exigua)的毒性(de Maagd等，1996)，而且存在關於設計Cry毒素域交換的指導(Knight等，0004)。用於生成重組蛋白和對它們測試殺蟲活性的方法是本領域公知的(參見例如 Naimov 等，2001 ；de Maagd 等，1996 ；Ge 等，1991 ；Schn印f 等，1990 ；Rang 等，1999)。已經對來自CrylA和Cry3A蛋白的域I研究了在膜中插入或形成孔的能力。域I的α -螺旋4和 5在膜插入或孔形成中發揮關鍵作用(Walters等，1993 ；Gazit等，1998 ；Nunez-Valdez等， 2001)，提出其它螺旋像傘骨那樣接觸膜表面(Bravo等，2007 ；Gazit等，1998)。通過進行有限數目的胺基酸刪除、替代、或添加而創建的DIG-5變體。可以容易地以連續方式進行對SEQ ID NO :2的胺基酸序列的胺基酸刪除、替代、和添加，而且可以通過生物測定法測試此類變異對殺蟲活性的影響。倘若變化的數目在數目方面是有限的，此類測試不涉及不合理的實驗。本發明包括其中已經進行了多至10個、多至15個、或多至20 個胺基酸的添加、刪除、或替代的核心毒素(SEQ ID NO 2胺基酸1-655或SEQ ID NO 2胺基酸114-655)的殺蟲活性變體。本發明包括具有與SEQ ID NO :2胺基酸1-655或SEQ ID NO :2胺基酸 114-65590 %、95 %或97 %相同的核心毒素區段的DIG-5變體。可以通過隨機突變來生成不同，或者可以設計變體。在設計突變體的情況中，當毒素的關鍵區中的胺基酸同一性得到維持時，有生成具有與天然毒素相似的活性的變體的高概率，該關鍵區負責生物學活性或涉及決定最終負責生物學活性的三維構象。如果替代是保守的話，也會發生保留活性的高概率。可以將胺基酸歸入下述類別非極性的，不帶電荷的極性的，鹼性的，和酸性的。其中一個類別的胺基酸用同一類型的另一種胺基酸替換的保守替代不大可能實質性改變變體的生物學活性。表2提供屬於每一個類別的胺基酸實例的列表。表 2。
權利要求
1.一種分離的多肽，其包含選自下組的核心毒素區段(a)包含SEQID NO 2殘基114至655的胺基酸序列的多肽；(b)包含與SEQID NO 2殘基114至655的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列的多肽；(c)包含SEQID NO 2殘基114至655的胺基酸序列及多至20個胺基酸的對由SEQ ID NO 2編碼的毒素的表達或活性沒有不利影響的替代、刪除、或修飾的多肽；或其殺蟲活性片段。
2.權利要求1的分離的多肽，其包含選自下組的核心毒素區段(a)包含SEQID NO 2殘基1至655的胺基酸序列多肽；(b)包含與SEQID NO :2殘基1至655的胺基酸序列具有至少90%序列同一性的胺基酸序列多肽；(c)包含SEQID NO :2殘基1至655的胺基酸序列及多至20個胺基酸的對由SEQ ID NO 2編碼的毒素的表達或活性沒有不利影響的替代、刪除、或修飾的多肽；或其殺蟲活性片段。
3.一種植物，其包含權利要求1的多肽。
4.一種植物，其包含權利要求2的多肽。
5.一種用於控制害蟲群體的方法，其包括使所述群體與殺蟲有效量的權利要求1的多肽接觸。
6.一種分離的核酸，其編碼權利要求1的多肽。
7.一種分離的核酸，其編碼權利要求2的多肽。
8.權利要求6的分離的核酸，其具有SEQID NO :1或SEQ ID NO 3的序列。
9.權利要求1的多肽，其為SEQID NO 2或SEQ ID NO :5。
10.一種DNA構建體，其包含可操作連接至啟動子的權利要求6的核苷酸序列，該啟動子不是源自蘇雲金芽孢桿菌(Bacillus thuringiensis)的且能夠在植物中驅動表達。
11.一種轉基因植物，其包含穩定摻入其基因組中的權利要求10的DNA構建體。
12.一種用於針對害蟲保護植物的方法，其包括將權利要求10的構建體導入所述植物中。
13.權利要求1或權利要求2的多肽，其具有針對玉米根蟲的活性。
14.權利要求11的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含用於阻抑玉米根蟲中的必需基因的dsRNA。
15.權利要求14的轉基因植物，其中所述必需基因選自下組液泡ATP酶，ARF-1， Act42A, CHD3, EF-I α，和 TFIIB。
16.權利要求11的轉基因植物，其中所述轉基因植物包含用於阻抑昆蟲害蟲中的必需基因的dsRNA。
全文摘要
公開了DIG-5Cry毒素、編碼此類毒素的多核苷酸、此類毒素控制害蟲的用途、和生成此類毒素的轉基因植物。
文檔編號C07K14/325GK102459316SQ201080032073
公開日2012年5月16日 申請日期2010年6月14日 優先權日2009年6月16日
發明者A.伍斯利, I.拉裡努阿, J.裡拉, K.納瓦, T.海伊 申請人:陶氏益農公司