一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記及其應用的製作方法
2023-05-03 01:27:16 2
本發明屬於分子生物學領域，涉及一種採用分子生物學手段檢測致病菌的方法，具體為一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記及其應用。
背景技術：
副溶血弧菌是水產品中引起食物中毒的重要病原菌之一，在海產品中的攜帶率高達45。7％。在我國沿海地區，由副溶血弧菌引起的食物中毒佔細菌性食物中毒事件首位，其中也包括臺灣省；在日本，由該菌引起的食物中毒佔第二位。所以，副溶血弧菌是食品安全檢測中的一項重要指標。但目前法定的副溶血弧菌檢測方法仍然是傳統培養方法，操作繁瑣、費時、費力，常常需要5～6天才能完成，而且鑑定副溶血弧菌的生化指標非常不穩定，常常需要重複實驗才能最終確定是否為副溶血弧菌，此類方法已不能滿足目前對大量食品樣品快速檢測的需求，急切需要建立一種快速、有效的檢測方法。
基於聚合酶鏈式反應的檢測方法具有靈敏、特異、快速等優點，因此，日益受到重視，並逐漸開始應用於副溶血弧菌的檢測。檢測靶點是分子檢測方法的關鍵，目前，用於副溶血弧菌pcr檢測的靶點在其他弧菌中也普遍存在，且同源性非常高，極易產生假陽性結果。此外，pcr檢測還易出現假陰性結果，這主要是由於抑制劑的存在等因素造成的。pcr技術雖然在不斷的得到發展與改進，但目前仍然沒有找到消除抑制劑的有效方法，極大程度上限制了該技術在實際檢測工作中的應用。
技術實現要素：
本發明的目的是：為了克服現有技術的缺陷，獲得一種能夠避免水產品中副溶血弧菌檢測過程中出現假陽性或假陰性結果，提高檢測結果的準確性，本發明提供了一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記及其應用。
技術方案：一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
優選的，所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
表1分子標記序列
所述的分子標記在製備檢測水產品中副溶血弧菌試劑盒中的應用。
優選的，所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
優選的，所述試劑盒檢測水產品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋50～500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10～50倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
優選的，所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
優選的，所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
優選的，所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
優選的，所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
優選的，所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
有益效果：(1)本發明所述分子標記具有特異性好的優點，能夠避免水產品中副溶血弧菌檢測過程中出現假陽性或假陰性結果，提高檢測結果的準確性；(2)本發明所述分子標記靈敏度高，提高了pcr檢測副溶血弧菌的可信度，為水產品中副溶血弧菌的檢測提供方便、準確、有效的方法。
附圖說明
圖1是實施例1～3檢測結果圖；
其中，m為分子量為2000bp的maker；1為實施例1pcr產物電泳結果；2為實施例2pcr產物電泳結果；3為實施例3pcr產物電泳結果。
具體實施方式
實施例1
一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在製備檢測水產品中副溶血弧菌試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測水產品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋50倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋50倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
實施例2
一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在製備檢測水產品中副溶血弧菌試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測水產品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋250倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋25倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
實施例3
一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記，所述分子標記及其序列為：p1，seqidno.1～2；p2，seqidno.3～4；p3，seqidno.5～6。
所述分子標記p1、p2和p3的上遊引物5』端進行氨基化修飾。
所述的分子標記在製備檢測水產品中副溶血弧菌試劑盒中的應用。
所述試劑盒的組分包括：分子標記、dntp、lataq、pcr反應緩衝液、mgcl2、雙蒸水。
所述試劑盒檢測水產品副溶血弧菌的步驟包括：
(1)取樣：提取水產品樣品的基因組dna；
(2)以步驟(1)提取的dna作為pcr模板，以p1為特異性引物，進行第一輪pcr擴增；
(3)取步驟(2)的擴增產物，稀釋500倍後作為第二輪pcr的模板，以p2作為特異性引物，進行第二輪pcr擴增；
(4)取第二輪pcr擴增的產物，稀釋10倍後作為第三輪pcr的模板，以p3作為特異性引物，進行第三輪pcr擴增；
(5)收集第三輪pcr擴增的產物，並採用瓊脂糖凝膠電泳檢測。
所述甘蔗葉片樣品的基因組dna的提取方法是試劑盒法或改良ctab法。
所述pcr擴增的體系為25μl：模板2μl、pcr反應緩衝液2.5μl、dntp2μl、lataq2μl、分子標記1μl、雙蒸水15.5μl。
所述第一輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，52℃，30s，72℃，55s，35個循環；72℃，7min。
所述第二輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，45s，35個循環；72℃，5min。
所述第三輪pcr擴增的程序為：95℃，2min；95℃，30s，55℃，30s，72℃，35s，35個循環；72℃，4min。
sequencelisting
蘇州蔻美新材料有限公司
一種用於檢測水產品中副溶血弧菌的分子標記及其應用
6
patentinversion3.3
1
21
dna
人工序列
1
ggtttggcttccaaggtgagc21
2
19
dna
人工序列
2
cgattcgcttgatcctgtc19
3
19
dna
人工序列
3
cgttagcggatgtaggtgt19
4
19
dna
人工序列
4
gggtctcgctcagcttgta19
5
21
dna
人工序列
5
ggtttaacctccaaggtgagc21
6
20
dna
人工序列
6
cgattcgcttgaagcctgtc20