小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法
2023-09-12 03:17:30
專利名稱：小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法
技術領域：
本發明涉及細胞的分離純化領域，主要是一種小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法。
背景技術：
早在1973年美國學者Weinman就發現了具有強大抗原遞呈功能的樹突狀細胞 (Dendritic cells，DC)。這類細胞是目前所知機體內功能最強的專職抗原遞呈細胞，它能高效地攝取、加工處理和遞呈抗原，未成熟DC具有較強的遷移能力，成熟DC能有效激活初始型T細胞，處於啟動、調控、並維持免疫應答的中心環節。它們通常少量分布於外界接觸的皮膚部位，主要為皮膚和鼻腔、肺、胃與腸的內層。而腸道作為人體最大的免疫器官。一方面腸道對各類致病微生物產生免疫應答，消除病原體；另一方面對腸道正常定植的共生菌和日常大量食物蛋白產生免疫耐受，在這一過程中，作為體內功能最強的抗原遞呈細胞，樹突狀細胞起到了關鍵的作用。腸道內各類抗原主要經過DC傳遞後，作用於T、B淋巴細胞，其產生的效應取決於DC的類型、接受到的信號分子以及局部微環境的影響。介於樹突狀細胞在腸道免疫的重要地位，如何分離提取高純度的DC成為首要任務。根據DC所在腸道位置的不同，主要可以分為在Peyer』 s淋巴結(Peyer』 s patch) DC，腸繫膜淋巴結(mesenteric lymph nodes, MLN)DC以及在腸道上皮黏膜固有層(lamia propria, LP)DC。目前在提取Pp DC和MLN DC方面已經比較成熟，且文獻報導較多。但在提取LPDC時，由於腸壁構成複雜，結構特殊，腸絨毛的固有層又含有緻密結締組織。所以導致了 LPDC提取的諸多困難。如何有效得提取腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞成了亟待解決的問題。
發明內容
本發明的目的正是要克服上述技術的不足，而提供一種小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法。本發明解決其技術問題採用的技術方案本發明公開了小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法，具體步驟①獲取混合細胞取出生4-6周的C57BL/6小鼠過度麻醉後，用外科手術剪剪開小鼠，取出小腸(十二指腸、空腸、迴腸)；將小腸置於37°預熱的HBSS BuffeH分離上皮細胞的緩衝液)中，去除脂肪、結締組織、淋巴結，並清洗內容物至乾淨；腸儘可能剪碎， 轉移至50毫升離心管中加入30毫升37°C預熱的HBSS Buffer，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升 37°C預熱的HBSS Buffer，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾， 棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升37°C預熱的RPMI清洗緩衝液，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升37°C預熱的RPMI清洗緩衝液，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入15毫升37°C預熱的 collagenase/DNase Solution (膠原酶/DNA酶混合液)，37°C水浴60分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，用RPMI清洗緩衝液清洗篩網，再用400目細胞篩過濾，濾液轉移至50毫升離心管中，1200轉/分鐘離心5分鐘。上述液體的配置如下a、HBSS稱取HBSS粉末4. 9g，加入500ml的去離子水，然後用0. 22 μ m濾膜過濾b、HBSS Buffer (分離上皮細胞的緩衝液)
HBSS47ml
FBS (5%)2.5ml
EDTA (0.05mM)5μ 1
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青黴素、鏈黴素(IOOx)500 μ 1
DTT (15ug/ml)5μ1c、RPMI清洗緩衝液
HBSS44.5ml
FBS (5%)5ml
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青黴素、鏈黴素(IOOx)500 μ 1d、collagenase/DNase Solution (膠原酶/DNA 酶混合液)RPMI Buffer9.75mlcollagenase (1. 75mg/ml) 5. 25mlDNase I0. 0075g②單個核細胞的獲取膠原酶消化後得到的細胞製成懸液，按1 1的體積緩慢加入小鼠淋巴細胞分離液中，1800轉/分鐘離心25分鐘；吸取中間白膜層，加入1-2毫升 MACS buffer (美天旎分選緩衝液)，1200轉/分鐘離心5分鐘；去除上清，重懸細胞。所述 MACS buffer是含有2mM (摩爾/毫升)的EDTA和0. 5 %的FCS (胎牛血清)的PBS (鹽離子緩衝液)。③腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的獲取=Ficoll密度梯度離心得到的細胞用 MACSbuffer重選，按照美天旎磁珠分選⑶Ilc的說明分選樹突狀細胞。本發明有益的效果是1、在 HBSS Buffer 中分別加入 DTT (DL-Dithiothreitol, 二硫蘇糖醇)和 EDTA(Ethylene Diamine Tetraacetic Acid，乙二胺四乙酸)處理腸道組織，前者有效得去除了上皮細胞，後者使得腸道組織變得疏散，為後續膠原酶消化提供很好的環境。
2、實驗過程簡單、可操作性強、重複性好。3、分離純化時間縮短為3-4個小時。區別與傳統獲得樹突狀細胞需要的7天時間。4、臺盼藍活細胞計數結果顯示，採用本方法，每隻老鼠約可獲得6-10E5，細胞活性 > 90%。5、在腸道上皮黏膜固有層分選出的樹突狀細胞不僅僅表達⑶11c，還表達⑶lib。 並且在流式細胞儀上可以清晰的看到四群不同的細胞，即⑶iichiraiibl°、⑶iichiraiibhi、 ⑶1 IcntOTlIbint、⑶Ilcint⑶Ilbhi。這與現有文獻提出的理論極其相似。6、避免了傳統分離純化細胞中的機械損傷，對細胞損傷小，最大限度的維持了細胞原有的形態特徵。7、區別於傳統研究樹突狀細胞，大多數利用不同劑量的粒細胞-巨噬細胞刺激因子(Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor GM-CSF)聯合或者不聯合重組小鼠白細胞介素-4(rmIL-4)誘導培養樹突狀細胞。但發明直接取得體內的樹突狀細胞，為直接研究體內免疫機制提供了可能。綜上所述，本發明方法可以方便、短時、經濟、高效地獲得大量純度高、活性好的腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞，所得細胞在體外條件下保持了良好的抗原遞呈能力，為體外模擬體內抗原遞呈細胞誘導淋巴細胞分化提供了良好條件。
圖1 ⑶Ilc磁珠分選後流式圖；圖2 ADllchiCDllb1t5 細胞群示意圖；圖中 PE CDllb, APC CDllc subset 11. 3%H 出的細胞為⑶Ilc1^Dllblt5細胞群，佔所有細胞的11.3% ；圖3 =CDllchiCDllbl"細胞示意圖；圖 4 =CDllchiCDllbhi 細胞群示意圖，圖中 PE CDllb, APC CDllc subset 22. 2%圈出的細胞為⑶llChiroilbhi細胞群，佔所有細胞的22. 2% ；圖5 =CDllchiCDllbhi 細胞示意圖；圖 6 :CDllcintCDllbhi 細胞群示意圖，圖中 PE CDllb,APC CDllc subset 9.02%圈出的細胞為⑶Ilcint⑶Ilbhi細胞群，佔所有細胞的9. 02% ；圖7 :CD1 ICintCDlIbhi 細胞示意圖；圖8 =CDllCintCDllbint 細胞群示意圖；圖中 PE CDlIb，APC CDllc subset 19. 2% 圈出的細胞為⑶Iicint⑶Ilbint細胞群，佔所有細胞的19.2% ；圖9 :CD1 ICintCDlIbint 細胞示意圖。所有圖橫坐標表示PE標記的⑶lib的螢光信號強弱，縱坐標為APC標記的⑶Ilc 的螢光信號強弱。
具體實施例方式為了使本發明的目的、技術方案及優點更加清楚明白，下面結合舉例，對本發明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的舉例僅僅用以解釋本發明，並不用於限定本發明。本發明公開了小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法，是將小鼠的小腸在去除腸繫膜淋巴結(mesenteric lymph nodes, MLN)、Peyer，s淋巴結(Peyer，s patch)的情況下，剪成碎末用膠原酶消化成單個細胞。利用Ficoll密度梯度離心法分離單個核細胞。最後用CDllc磁珠分選腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞。本發明可以方便、短時、經濟、高效地獲得大量純度高、活性好的腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞。具體步驟如下①獲取混合細胞取出生4-6周的C57/B6小鼠過度麻醉後，用外科手術剪剪開小鼠，取出小腸(十二指腸、空腸、迴腸)；將小腸置於37°預熱的HBSS Buffer中，去除脂肪、 結締組織、淋巴結，並清洗內容物至乾淨；腸儘可能剪碎，轉移至50毫升離心管中加入30毫升37°C預熱的HBSS Buffer，37°C水浴15毫升，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾， 棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升37°C預熱的HBSS Buffer, 37°C水浴15 分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50ml離心管中加入25ml 37°C預熱的RPMI Buffer，37°C水浴15min，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50ml離心管中加入25ml 37°C預熱的RPMI清洗緩衝液，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入15毫升37°C預熱的collagenase/DNase Solution，37°C水浴60分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，用RPMI清洗緩衝液清洗篩網，再用400目細胞篩過濾， 濾液轉移至50毫升離心管中，1200轉/分鐘離心5分鐘。上述液體的配置如下a、HBSS稱取HBSS粉末4. 9g，加入500ml的去離子水，然後用0. 22 μ m濾膜過濾b、HBSS Buffer (分離上皮細胞的緩衝液)
HBSS47ml
FBS (5%)2.5ml
EDTA (0.05mM)5μ 1
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青黴素、鏈黴素(IOOx)500 μ 1
DTT (15ug/ml)5μ1c、RPMI清洗緩衝液
HBSS44.5ml
FBS (5%)5ml
HEPES (0.6mM)30 μ 1
青黴素、鏈黴素(IOOx)500 μ 1d、collagenase/DN ase SolutionRPMI Buffer9.75mlcollagenased. 75mg/ml) 5. 25ml
DNase I0. 0075g②單個核細胞的獲取膠原酶消化後得到的細胞製成懸液，按1 1的體積緩慢加入小鼠淋巴細胞分離液中，1800轉/分鐘離心25分鐘；吸取中間白膜層，加入1-2毫升MACS bufferl200轉/分鐘離心5分鐘；去除上清，重懸細胞。所述MACS buffer是含有2mM的 EDTA 和 0. 5 % 的 FCS 的 PBS。③腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的獲取=Ficoll密度梯度離心得到的細胞用 MACSbuffer重選，按照美天旎磁珠分選⑶Ilc的說明分選樹突狀細胞。可以理解的是，對本領域技術人員來說，對本發明的技術方案及發明構思加以等同替換或改變都應屬於本發明所附的權利要求的保護範圍。
權利要求
1.一種小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法，其特徵在於具體步驟①獲取混合細胞取出生4-6周的C57BL/6小鼠過度麻醉後，剪開小鼠，取出小腸；將小腸置於37°預熱的分離上皮細胞的緩衝液HBSS Buffer中，去除脂肪、結締組織、淋巴結，並清洗內容物至乾淨；小腸剪碎後轉移至50毫升離心管中加入30毫升37°C預熱的 HBSSBufTer，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升37°C預熱的HBSS Buffer，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升 37°C預熱的RPMI清洗緩衝液，37°C水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入25毫升37°C預熱的RPMI清洗緩衝液，37°C 水浴15分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，棄上清，組織塊轉移至50毫升離心管中加入15毫升37°C預熱的collagenase/DNase Solution膠原酶/DNA酶混合液，37°C 水浴60分鐘，每5分鐘劇烈混搖一次；200目細胞篩過濾，用RPMI清洗緩衝液清洗篩網，再用400目細胞篩過濾，濾液轉移至50毫升離心管中，1200轉/分鐘離心5分鐘；②單個核細胞的獲取膠原酶消化後得到的細胞製成懸液，按1 1的體積緩慢加入小鼠淋巴細胞分離液中，1800轉/分鐘離心25分鐘；吸取中間白膜層，加入1-2毫升MACS buffer美天旎分選緩衝液，1200轉/分鐘離心5分鐘；去除上清，重懸細胞；所述MACS buffer是含有2mM摩爾/毫升的EDTA和0. 5%的FCS胎牛血清的PBS鹽離子緩衝液；③腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的獲取=Ficoll密度梯度離心得到的細胞用 MACSbuffer重選，按照美天旎磁珠分選⑶Ilc的說明分選樹突狀細胞。
2.根據權利要求1所述的小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法，其特徵在於上述液體的配置如下a、HBSS稱取HBSS粉末4. 9g，加入500ml的去離子水，然後用0. 22 μ m濾膜過濾；b、HBSSBuffer分離上皮細胞的緩衝液HBSS47mlFBS 5%2.5mlEDTA 0.05mM5 μ 1HEPES 0.6mM30 μ 1青黴素、鏈黴素IOOx500 μ 1DTT 15ug/ml5μ 1c、RPMI清洗緩衝液HBSS44.5mlFBS 5%5 mlHEPES 0.6mM30 μ 1青黴素、鏈黴素 IOOx500 μ 1d、collagenase/DNaseSolution 膠原酶 /DNA 酶混合液RPMI Buffer9.75mlCollagenase 1. 75mg/ml5.25mlDNase I0.0075go
全文摘要
本發明涉及一種小鼠腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的分離純化方法，具體步驟①獲取混合細胞。②單個核細胞的獲取膠原酶消化後得到的細胞製成懸液，按1∶1的體積緩慢加入小鼠淋巴細胞分離液中，1800轉/分鐘離心25分鐘；吸取中間白膜層，加入1-2毫升MACSbuffer美天旎分選緩衝液，1200轉/分鐘離心5分鐘；去除上清，重懸細胞。所述MACS buffer是含有2mM摩爾/毫升的EDTA和0.5％的FCS胎牛血清的PBS鹽離子緩衝液。③腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞的獲取。本發明有益的效果是方便、短時、經濟、高效地獲得大量純度高、活性好的腸道上皮黏膜固有層樹突狀細胞，所得細胞在體外條件下保持了良好的抗原遞呈能力，為體外模擬體內抗原遞呈細胞誘導淋巴細胞分化提供了良好條件。
文檔編號C12N5/0784GK102382802SQ201110318698
公開日2012年3月21日 申請日期2011年10月19日 優先權日2011年10月19日
發明者張勻, 梁廷波, 白雪莉, 陳偉, 陳靈曉 申請人:梁廷波