用於抑制消化道腫瘤幹細胞增殖、分化和乾性誘導的藥物的製作方法
2023-09-12 20:15:40
本發明屬於藥物技術領域，具體涉及用於抑制消化道腫瘤幹細胞增殖、分化和乾性誘導的藥物。
背景技術：
隨著對腫瘤異質性研究的深入，傳統的克隆演進學說受到新興腫瘤幹細胞（cancer stem cells，CSCs）學說的挑戰。CSCs學說認為腫瘤組織是由處於不同分化層級的腫瘤細胞組成的，其中CSCs位於腫瘤細胞群體的頂端，能僅以10-100個細胞即可在宿主體內形成一個與人體腫瘤性質相同的腫瘤，是造成腫瘤的異質性的根本所在。2006年，美國癌症研究協會定義CSCs為存在於腫瘤中的一小群具有自我更新、多向分化潛能及高致瘤性的腫瘤細胞，也稱腫瘤起始細胞（tumor initiating cells，TICs）。至今為止，已在白血病、膠質瘤、乳腺癌、結直腸癌和肺癌等多種腫瘤中分離鑑定出CSCs。愈來愈多的實驗證據表明，CSCs除具有自我更新、多向分化和高致瘤特性外，也是腫瘤血管生成、耐藥、侵襲、轉移及復發的根本所在。臨床常規的化療藥物，如順鉑、環磷醯胺、5-氟尿嘧啶、卡培他濱等，雖然能殺死腫瘤組織中大多數亞型的腫瘤細胞，但對CSCs的抑制或殺死作用則非常有限，甚至會誘導部分腫瘤亞型細胞乾性增強，從而導致腫瘤耐藥、復發及轉移。因此，靶向CSCs的診斷和治療，有望成為完全防治腫瘤的新途徑，已成為腫瘤研究領域的前沿和熱點。
技術實現要素：
針對現有技術存在的問題，本發明的目的在於設計提供一種用於抑制消化道腫瘤幹細胞增殖、分化和乾性誘導的藥物的技術方案。
所述的用於抑制消化道腫瘤幹細胞增殖、分化和乾性誘導的藥物，其特徵在於含有有效成分小檗鹼。
所述的藥物，其特徵在於所述的消化道腫瘤幹細胞包括胃癌幹細胞、結腸癌幹細胞和肝癌幹細胞。
所述的藥物，其特徵在於該藥物為原型藥或其藥學上可接受的鹽。
所述的小檗鹼在製備抑制消化道腫瘤幹細胞增殖、分化和乾性誘導的藥物中的應用。
所述的應用，其特徵在於所述的消化道腫瘤幹細胞包括胃癌幹細胞、結腸癌幹細胞和肝癌幹細胞。
所述的小檗鹼在增加常規化療藥對消化道腫瘤幹細胞的療效和減少常規化療藥對消化道腫瘤幹細胞的耐藥性中的應用。
所述的小檗鹼在減少常規化療藥引起的消化道腫瘤幹細胞乾性增強中的應用。
所述的一種增加常規化療藥對消化道腫瘤幹細胞的療效和減少常規化療藥對消化道腫瘤幹細胞的耐藥性的藥物，其特徵在於含有小檗鹼和化學化療藥。
所述的一種減少常規化療藥引起的消化道腫瘤幹細胞乾性增強的藥物，其特徵在於含有小檗鹼和化學化療藥。
本發明一方面提供了一種抑制消化道腫瘤幹細胞增殖、分化和乾性誘導的藥物，該藥物能夠抑制消化道腫瘤幹細胞的增值、轉移和分化，並且該藥物能夠減少常規化療藥物所引起的腫瘤細胞乾性化；本發明另一方面提供了小檗鹼的一種新用途。
附圖說明
圖1為螢光定量 PCR 檢測各腫瘤細胞及其幹細胞中乾性基因的表達；
圖2 為小檗鹼和順鉑對原代腫瘤細胞及其腫瘤幹細胞的抑制作用；
圖3為小檗鹼對腫瘤幹細胞的誘導凋亡作用；
圖4為小檗鹼對裸鼠皮下腫瘤組織生長的抑制作用；
圖5為小檗鹼對荷瘤裸鼠體重變化的影響；
圖6為小檗鹼對裸鼠皮下腫瘤組織中相關基因表達的影響；
圖7 為小檗鹼對腫瘤幹細胞化療敏感性的作用。
具體實施方式
下面詳細描述本發明的實施例，所述實施例的示例在附圖中示出，其中自始至終相同或類似的標號表示相同或類似的元件或具有相同或類似功能的元件。下面通過參考附圖描述的實施例是示例性的，僅用於解釋本發明，而不能理解為對本發明的限制。
實施例1 腫瘤幹細胞的分離鑑定
人胃腺癌細胞系 SGC7901、MKN28；人結腸癌HT29、SW620；人肝癌細胞系Huh7、SMMC-7721，使用本實驗室細胞凍存庫。
本研究採用國際常用的無血清飢餓培養法，從現有細胞系中分離、富集腫瘤幹細胞。具體操作如下：分別取對數生長期的上述各類型的癌細胞，經胰酶消化，分別製成單細胞懸液，使用 PBS 洗滌離心去除殘留的血清後，作細胞計數，取 2 萬個細胞接種於 10 cm 超低粘附培養皿中，添加含 B27（1×）及 EGF 5ng/ml 的 DMEM/F12 培養基 10 ml，培養 3-5 天，即可見有細胞球生長，為第一代腫瘤幹細胞球；每隔 5 天對細胞球進行傳代，用移液器吹打細胞球以求吹散細胞球，注意操作輕柔，儘量吹打成單個細胞；離心收集細胞球，按 1:3 比例傳代接種於 DMEM/F12 幹細胞培養基，繼續培養擴增，到 10-14 天時，吹打細胞球成單細胞，離心後接種於含 10% FBS 的完全培養基中，貼壁 1h，去除沒有貼壁的凋亡細胞，使用貼壁細胞進行後續實驗。
分別取各類型腫瘤幹細胞適量，提取總RNA，進行cDNA合成，PCR 反應條件如下：
a．定量引物：
b．定量反應程序
反應體系：cDNA 1μl、上遊引物0.5μl、下遊引物0.5μl、2xSYBR mix 10μl、水8μl，總量為20μl。
反應程序：
預變性 95℃ 1min，變性 95℃ 10sec，退火55℃ 10sec，延伸 72℃ 30sec，40 個循環。在循環結束後立即進行融解曲線測定，檢測溫度為 65℃-95℃，升溫速率為 0.5℃/sec，恆溫時間為 1sec/次。
經無血清飢餓培養法，大部分腫瘤細胞死亡，少數細胞團抱成球生長；收集細胞球（即為腫瘤幹細胞CSC），按 1:3 比例傳代接種於 DMEM/F12 幹細胞培養基，繼續培養擴增至所需實驗數量。採用螢光定量PCR技術，比較CSC和原代細胞系細胞中的乾性相關轉錄因子Klf4、Oct4、NANOG、Sox2 以及乾性相關基因 Bmi-1 的表達。結果如圖1顯示，各細胞系誘導的腫瘤幹細胞中Klf4、Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1的表達均顯著高於原代細胞系的表達，證明這些細胞球具有幹細胞特性。
根據乾性基因表達鑑定結果，選取乾性基因表達最高的第三代誘導細胞球(CSC-3)，輕輕吹打製備成單細胞懸液，用無血清培養液稀釋細胞至200ul 中含所需細胞數(見表1)，用無菌注射器將 200μl 細胞懸液接種於 4～6 周齡裸鼠腋下或者腹股溝(裸鼠均為雄性)，飼養於標準無菌條件的 ICU 單元，每隔 3-5 天觀察動物生長及成瘤情況。
實驗結果如表1所示，在裸鼠體內 1×104-5×104個腫瘤幹細胞即可引起腫瘤的發生；而原代腫瘤細胞需在5×106個細胞數目的條件下接種，才能引起小鼠皮下腫瘤生長。證明本實驗誘導的腫瘤幹細胞比原代腫瘤細胞具有更強的致癌特性。
表1裸鼠皮下移植不同腫瘤細胞數的成瘤情況
註：- 表示未檢測；m/n，m表示成瘤的裸鼠數量，n表示用於實驗的裸鼠數量。
實施例2 小檗鹼對原代腫瘤細胞及其腫瘤幹細胞的體外抑制作用
選用對數生長期的貼壁腫瘤幹細胞，用胰酶消化後，用含10％小牛血清的RPMI l640培養基配成50000個/ml的細胞懸液，接種於96孔培養板中，每孔接種100 μl，37℃，5％CO2培養24 h。實驗組加入含不同濃度藥物的無血清培養基，對照組則換含等體積溶劑的培養基，每組設3-6個平行孔，37℃，5％CO2培養48h。每孔加入20 μl新鮮配製的含0.2 mg/ml MTT的無血清培養基，37℃繼續培養4 h。小心吸去上清，並加入150 μl DMSO，用微型超聲振蕩器混勻後，在酶標儀上以試驗波長為570 nm，參比波長為450 nm測定光密度值。
圖2結果所示，在同等給藥劑量（50μM）下, 小檗鹼無論是對原代腫瘤細胞，還是對腫瘤幹細胞體外增殖的抑制作用均明顯高於順鉑；而順鉑對腫瘤幹細胞體外增殖的抑制作用明顯弱於對原代腫瘤細胞體外增殖的抑制作用，但小檗鹼則對兩者的抑制作用基本相當；此外，兩者聯合給藥後（各25μM劑量），可提高對原代腫瘤細胞和腫瘤幹細胞的抑制作用。證明小檗鹼可以顯著抑制腫瘤幹細胞的體外增殖，且與順鉑聯用，可以提高順鉑的化療效果。
實例3 小檗鹼對腫瘤幹細胞的誘導凋亡作用
各腫瘤幹細胞分別用含10%FBS1640培養基貼壁培養24h後，分別用小檗鹼(50μM)、順鉑(50μM)、小檗鹼+順鉑(25μM+25μM)聯合用藥處理24h後，每組收集細胞1x105 cells，用PBS清洗兩次，用1x Binding Buffer重懸細胞，加入5µl FITC Annexin V和5µl PI輕輕混勻，25°C處理15min後進行流式分析。每組樣品平行檢測5次。
圖3結果所示，小檗鹼可誘導各腫瘤幹細胞發生凋亡，其細胞凋亡率均在50%以上，而順鉑誘導各腫瘤幹細胞發生凋亡的作用則相對較弱；小檗鹼和順鉑聯用後，可明顯增加腫瘤幹細胞的凋亡率，證明小檗鹼對化療藥的腫瘤幹細胞抑制具有增效作用。
實例4 小檗鹼對裸鼠皮下腫瘤組織生長的抑制作用
根據實例1移植瘤結果，分別選取乾性基因表達最高的第三代誘導的腫瘤幹細胞，輕輕吹打製備成單細胞懸液，500 rcf離心 5 min 收集細胞，經PBS洗滌後，再以PBS重懸細胞，用血球計數板計數後，用無血清培養液稀釋細胞至200μl，其所含細胞數為5×104個腫瘤幹細胞，用無菌注射器將 200μl 細胞懸液接種於 4 周齡雄性裸鼠腋下或者腹股溝，飼養於標準無菌條件的ICU單元，每隔 3-5 天觀察動物生長及成瘤情況。觀察成瘤裸鼠瘤塊體積約100mm3大小開始給藥，實驗設置成瘤不給藥對照組、小檗鹼治療組(10mg/kg)、順鉑治療組(10mg/kg)、卡培他濱(1000mg/kg)，每3天給藥一次，共給藥6次。每次給藥後觀察記錄實驗組裸鼠體重和瘤體體積變化。
圖4結果所示，小檗鹼在10mg/kg的給藥劑量下能顯著抑制各裸鼠皮下腫瘤的體積，且作用強於順鉑（10mg/kg）。圖5結果所示，與模型組相比較，小檗鹼治療組荷瘤裸鼠鼠體重相對略重，而順鉑給藥組體重明顯減輕，證明小檗鹼毒對荷瘤裸鼠的毒副作用相對較小。
實例5 小檗鹼對裸鼠皮下腫瘤組織中相關基因表達的影響
分別取各組腫瘤幹細胞適量，提取總RNA，進行cDNA合成。根據實例1的PCR條件和引物序列，採用螢光定量PCR技術，測定各組腫瘤組織中相關乾性基因Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1 mRNA的表達。儘管如實例4中圖4結果所示，給予順鉑治療後可明顯縮小幹細胞誘導的腫瘤大小，但結果如圖6顯示，各順鉑給藥組腫瘤組織中Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1 mRNA的表達均顯著高於對照組腫瘤組織的表達，證明順鉑可誘導腫瘤幹細胞的乾性增強，對於後續腫瘤的耐藥、轉移、復發增加風險性；而給予小檗鹼治療後，腫瘤組織中的Oct4、NANOG、Sox2、Bmi-1mRNA的表達均顯著高於對照組和順鉑給藥組腫瘤組織的表達，證明小檗鹼可逆轉腫瘤幹細胞乾性的表達。
實例6 化療敏感性實驗
將無血清富集的腫瘤幹細胞收集於15ml的離心管中，在水平離心機上以1000rpm離心5 min，收集細胞沉澱，利用ACCUTASE細胞消化液置於37°C消化，細胞計數，以每孔3000個細胞的密度均勻種植於96孔板，每板中各種細胞分別5個復孔，每孔100μl的無血清培養基，低粘附96孔板在二氧化碳培養箱培養過夜；種板後第1天，去除培養基，更換為含有不同濃度梯度順鉑（DDP）的培養基培養24h；取出96孔板，MTT每孔20μl，輕輕搖晃後將培養板至於細胞培養箱；4h後將培養板至680型酶標儀檢測490nm吸光度值。
對化療藥物耐藥也是腫瘤幹細胞的特徵之一。因此，耐藥是腫瘤復發的根源，也是腫瘤治療的難點。目前文獻報導的順鉑體外抑制腫瘤細胞的半數有效抑制濃度（IC50值）在10μg/ml左右，而圖7結果所示，在該劑量下，順鉑對各腫瘤幹細胞的抑制作用僅20%以下，即高達80%的腫瘤幹細胞仍存活，證明各腫瘤幹細胞對順鉑的耐藥性明顯增加，而在同等條件下，給予小檗鹼處理，對各腫瘤幹細胞的抑制作用明顯優於順鉑，證明小檗鹼具有更強的抗腫瘤幹細胞耐藥性的特點。