腸道病毒71型感染性克隆及構建方法
2023-09-19 05:33:30 1
專利名稱：腸道病毒71型感染性克隆及構建方法
技術領域：
本發明涉及一種正鏈RNA病毒的感染性克隆，尤其涉及腸道病毒71型感染性克隆及其構建方法。
背景技術：
由腸道病毒71型(Enterovirus type 71 ；EV71)引起的嬰幼兒手足口病常形成大範圍爆發流行，其主要臨床特徵為發熱和手足、口腔等部位的皮疹、潰瘍，個別患者還可引起心肌炎、肺水腫、無菌性腦膜炎等致命性併發症。手足口病四季均發病，人群對引起手足口病的腸道病毒普遍易感，但病毒隱性感染與顯性感染之比為100 1，成人大多已通過隱性感染獲得相應抗體，因此，手足口病患者主要為學齡前兒童。目前國內對EV71引起的手口足病尚無有效的治療藥物和疫苗，主要依靠預防綜合防治措施。2008年以來EV71在我國大陸廣泛流行，疫情在全國各地蔓延開來，其來勢更洶湧、更嚴重，EV71導致的疾病給家庭和社會帶來了沉重的負擔。因此需要建立感染性克隆，特別是迫切需要利用本土流行毒株構建感染性克隆，來研究其致病機理、病毒變異與毒力關係，並用於製備疫苗。這一工作顯得尤為迫切和重要。
發明內容
本發明目的之一是提供一種構立EV71感染性克隆的方法；本發明目的之二是在前述基礎上提供一種針對正鏈RNA病毒高效拯救系統；本發明目的之三是在前述基礎上提供一種EV71病毒的cDNA克隆的重組質粒。本發明的上述目的是通過如下技術方案予以實現的本發明的腸道病毒71型感染性克隆的構建方法是a.以從EV17病毒毒株提取的RNA為模板，用下述三對引物分別擴增出Li、L2和 L3三個片段，所用的三對引物為Ll上遊引物atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctata gtcLl 下遊弓丨物:gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaagL2 上遊弓丨物ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagatL2 下遊弓I物:tttgagatctgattctctagaagtggcagctgtL3 上遊弓丨物:tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaatL3 下遊引物:ttttctagagcggccgctTO ；b.將Ll片段經酶切後與真核表達載體連接，再轉化至大腸桿菌中獲得亞克隆質粒PLl，再將經PLl質粒與L2片段經酶切後連接轉化為質粒PL2，再將質粒PL2與L3片段經酶切後連接轉化，獲得含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒；c.將b所得到的含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒轉染至非
3洲綠猴腎細胞宿主細胞，得到EV711型感染性克隆。本發明的腸道病毒71型感染性克隆的構建方法中所用真核表達載體為 pcDNA3. 1(+)，所用的大腸桿菌為JM109 ；如此得到的三個亞克隆質粒分別是pPLl質粒、 PPL2質粒和pPL3質粒；所得到的含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒為 pPev3. 1 (+)重組質粒。以前述優選方式得到的全基因組cDNA克隆的重組質粒為pPev3. 1⑴重組質粒。EV71是小RNA病毒科腸道屬中的一員，根據衣殼蛋白VPl區的核苷酸序列的不同， EV71可以分為A、B、C三個基因型，其中B型和C型又進一步劃分為B1、B2、B3、B4以及Cl、 C2、C3、C4和C5亞型，而C4亞型又細分為Wa和C4b亞群。EV71基因組為長度約7. 5nts 的單股正鏈RNA，病毒在複製過程中不經歷DNA中間體，而常規基因工程操作技術都是在 DNA分子水平上進行操作的，對EV71的分子病毒學領域的相關研究因此受到限制。本發明是利用EV71病毒的全長cDNA為模板，體內或體外轉錄出感染性的RNA分子，以拯救出RNA 病毒。感染性克隆是將病毒DNA逆轉錄為cDNA，藉助載體構建病毒的全長cDNA分子克隆， 同時將RNA聚合酶的啟動子調控元件也導入該分子克隆中，由含病毒基因組cDNA的質粒獲取RNA病毒的一項技術。由於最終獲取的RNA病毒來源於cDNA克隆，通過人為加入的DNA 環節，實現了在DNA水平上對RNA病毒基因組進行各種修飾或改造，然後通過拯救病毒的表型變化來判定這些基因操作的效果，從而為篩選無神經毒或低神經毒的EV71基因工程疫苗毒株提供條件，同時也可為研究RNA病毒的致病機制、致弱機理提供便利。本發明有如下優點1)根據通過分子克隆技術獲得的EV71全基因組序列，所設計的特異性引物可擴增覆蓋整個基因組；2)本發明以EV71病毒的RNA為模板，反轉錄合成cDNA，同時，利用帶修飾的特異性引物分別擴增覆蓋基因組的3個片段，獲得的三個片段的cDNA兩端分別含有不同的酶切位點，擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳，純化回收後，可分別與克隆載體連接，建立亞克隆；3)為了利用單一限制性酶切位點連接病毒全長基因，本發明採用沉默突變，在所述基因組第4240位人為引入^CbaI位點，同時這一位點也可作為區別於親本毒的分子標記；利用雙酶切方法將三個片段的cDNA依次定向克隆至改造的pcDNA3. 1(+)載體，構建了含EV71基因組全長cDNA分子克隆的重組質粒pPev3. 1(+)。以非洲綠猴腎細胞(Vero) 為受體細胞，獲得所需感染性克隆。上述構建過程中，用RT-PCR方法分三個片段擴增EV71的全長cDNA時，在基因組非編碼區前引入了聚合酶I和聚合酶II雙啟動子的核心序列，為了利用單一酶切位點連
接病毒全長基因，採用沉默突變的方法，在不改變編碼胺基酸的前提下通過擴增引物將鳥嘌呤((^424tl)變成胸腺嘧啶(T)從而引入)(bai酶切位點，並可以作為區別於親本毒的遺傳標記；5)本發明構建EV71全長感染性cDNA克隆的方法分三個片段擴增病毒的基因組，所擴增的片段相對較短，且採用適合長片段擴增、性能優良的聚合酶I^emix υΓ ^ Version 2. 0 (TaKaRa公司)進行擴增，使用時只需在制品溶液中加入模板和引物便可進行 PCR反應，大大簡化了操作過程，減少了 PCR操作過程中的汙染。從而能夠更好的保證所擴
4增片段序列的保真性，病毒基因組位於含聚合酶I和聚合酶II雙啟動子真核質粒的下遊， 末端具有終止轉錄翻譯的終止子和限制性內切酶NotI位點，能夠保證感染性克隆在受體細胞內包裝出高豐度高質量的病毒粒子，因此用本發明方法所構建EV71的感染性克隆高效穩定，由該拯救系統所拯救的EV71在宿主細胞上的生長特性、致病性與親本毒具有較高的一致性。6)本發明方法操作簡便，成功率高，難度較小，可成功構建我國大陸EV71流行毒株的感染性cDNA分子克隆。
圖1是表示覆蓋基因組的3個cDNA片段，在圖1中，1 :L1片段擴增產物；2 12片段擴增產物；3 :L3片段擴增產物；M :500-12000bp的DNA marker。；圖2是表示構建全長cDNA的技術流程圖；圖3是含病毒全長cDNA重組質粒的鑑定；圖4沉默突變引入的^CbaI位點的分子標籤序列；圖5在Vero細胞上產生的細胞病變圖；圖6感染Vero細胞的間接免疫螢光檢測結果。
具體實施例方式以下是本發明的一個實施例，這一實施例所用的EV71病毒毒株系2010年分離自蘭州市臨床診斷手口足病患兒的糞便，並經人腸道通用病毒、柯薩奇病毒(coxsackievirus types A 16，CA16)和腸道病毒EV71型RT-PCR特異性核酸檢測以及實時螢光定量PCR平行檢測後得到的陽性標本，命名為EV71LanzhoU/01，分子流行病學基因分型為Wa型，EV71 Lanzhou/01毒株保藏於蘭州生物製品研究所，凍存於-70°C。本實施例用於說明本發明，但本發明並不局限於本實施例。實施例1. EV71病毒基因組的獲得。根據對EV71病毒的分子生物學研究，參考GenBank (GenBank登錄號⑶396280) 公開的相關序列，通過比較分析後，設計出帶修飾擴增覆蓋全基因組的三對特異性引物Ll 上、下遊引物，L2上、下遊引物和L3上、下遊引物，這三段特異性引物分別是Ll上遊引物atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctata gtcLl 下遊弓丨物RaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaagL2 上遊弓丨物ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagatL2 下遊弓丨物:tttgagatctgattctctagaagtggcagctgtL3 上遊弓丨物:tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaatL3 下遊引物ttttctaga￡cggccgct38 ；在以上的特異引物中，擴增Ll片段所用上遊引物Ll中加入I^cI酶切位點和含聚合酶I、聚合酶II雙啟動子，以保證在轉錄時產生高豐度高質量的RNA，其下遊引物Lf含 HindIII酶切位點；擴增L2片段所用上遊引物L2含HindIII酶切位點，其下遊引物L2—和擴增L3片段的上遊引物L3中引入點突變，擴增後將基因組第4240位的G突變為T，突變後密碼子CTT與突變前密碼子CTG均編碼亮氨酸，為同義突變，獲得的序列tctaga為限制件內切酶^CbaI的識別序列，能夠用於基因組全長cDNA的拼接，同時也作為區別於親本毒的遺傳標記；擴增L3片段所用下遊引物L3、含NotI酶切位點和38nt的poly (A)。從臨床診斷手口足病患兒的糞便中得到的EV71病毒毒株中得到RNA，以其為模板，用上述特異性引物分別進行擴增，得到基因組的Li、L2和L3三個片段，大小分別為 1448bp,2906bp和3197bp (圖1)，與預期大小相符。以上述EV71病毒RNA反轉錄後的cDNA 為模板，分別以Ll上、下遊引物，L2上、下遊引物，L3上、下遊引物為擴增引物，使用適合長片段擴增、性能優良的I^emix LATaq Version 2. O (TaKaRa公司)DNA聚合酶擴增出上述Li、L2和L3三個片段。按照產品說明書構建50 μ L反應體系，三個片段的擴增條件分別為片段 Ll :94°C 5min，94°C 30s, 57°C 30s, 68°C lmin30s, go to 2，72°C 8min ；片段 L2 94°C5min，94°C30s，57°C30s，68°C3min，go to 2，72°C8min ；片段L3 :94°C 5min，94°C 30s， 57°C 30s, 68°C 3min20s，go to 2，72°C 8min ；PCR擴增產物經0. 8%瓊脂糖凝膠電泳核實後進行純化回收，獲得上述三個片段的DNA。擴增產物的電泳結果如圖1所示。將上述Li，L2和L3三段分別進行切膠回收，分別與pMD20_T Vector連接，轉化感受態細胞以及陽性克隆篩選等本領域技術人員的常規操作，將篩選出的三個片段的陽性克隆pMD-Ll、pMD-L2和pMD_L3送交測序，測序獲得的三個片段再通過相應的軟體進行拼接， 最終獲得EV71病毒Lanzhou/10株的基因組。EV71病毒基因組全長cDNA克隆的構建。將pcDNA3. 1 (+)載體與前述得到的Ll片段分別用I^cl/Hindlll雙酶切後，連接轉化至JM109，測序鑑定陽性克隆，獲得含Ll片段的亞克隆質粒pPLl ；將pPLl與實例1得到的L2片段分別用HindIIIAbaI雙酶切後，連接轉化至JM109，測序鑑定陽性克隆，獲得含Ll和L2片段的亞克隆質粒pPL12 ；將pPL12與實例1得到的L3片段分別用Xbal/NotI 雙酶切後，連接轉化至JM109，測序鑑定陽性克隆，獲得含L1、L2和L3片段的全基因組cDNA 克隆的重組質粒pPev3. 1 (+)，參見圖2所示。將上述所構建全基因組(^嫩克隆的重組質粒？ 撲3.1(+)各201^分別用)0^1和 PstI進行酶切鑑定，37°C 2. 5h，用0. 8%瓊脂糖凝膠電泳對酶切產物進行分析，用I^stI酶切後產生4個片段分別為4672bp、^87bp、2753bp和1889bp ；用XbaI酶切後產生一個片段大小為13601bp，表明重組質粒含有第4240位突變形成的^CbaI酶切位點，酶切鑑定結果表明，酶切所得的片段與預期結果一致，對其進行測全序。在圖3中，1 重組質粒pPev3. 1 (+) XbaI 酶切產物；2 重組質粒 pPev3. 1 (+)PstI 酶切產物；3 :500-12000bp 的 DNA marker。初步證明成功克隆到了 EV71基因組的全長cDNA。本實施例中所涉及的雙酶切、連接和轉化等步驟，均採用本領域的常規操作。病毒拯救和鑑定用 Promega 公司生產的 Wizard SV Genomic DNA Purification System 製備純化由實例2得到的含全基因組cDNA的重組質粒pPev3. 1⑴。待Vero單層生長至80% 90%滿時用於轉染。轉染時各取MyL重組質粒pPev3. 1(+)和30 μ L Lipofectamine 2000 (Invitrogen)脂質體介導轉染Vero細胞。同時設立脂質體對照和正常細胞對照。轉染後4- 吸去細胞上清，加入2mL含10%胎牛血清的DMEM培養基，置
6370C CO2繼續培養5d後收穫病毒，反覆凍融3次後連續在Vero上傳代，待第二代72h出現特徵性細胞病變(CPE)(如圖5所示)。在圖5中，A 拯救病毒感染Vero細胞出現的CPE 的圖片；B 正常對照細胞圖片。對收穫的病毒分別用RT-PCR、分子標籤測序、間接免疫螢光等進行鑑定(如圖4，6所示)，均證實成功拯救到了 EV71 Lanzhou/01株病毒。圖4為沉默突變引入的)(bal位點的分子標籤序列(下劃線部分為^CbaI位點序列，黑三角為相應的突變位點)；在圖6中，A 為拯救病毒感染Vero細胞的免疫螢光圖片；B 為正常對照細胞的免疫螢光圖片。本實施例中所涉及的RT-PCR、間接免疫螢光等步驟，均採用本領域的常規操作。 由上步驟所得到的EV7 Lanzhou/01感染克隆毒株全基因序列見SEQ ID8，而用引物L2/L2—擴增的產物L2的序列見SEQ ID7。
權利要求
1.腸道病毒71型感染性克隆的構建方法，其特徵是a.以從EV17病毒毒株提取的RNA為模板，用下述三對引物分別擴增出L1、L2和L3三個片段，所用的三對引物為Ll上遊引物atagtcttaattaatgttaagcgtctgatgagtccgtgaggacgaaactataggaaaggaattcctatagtcLl 下遊弓I物:gaagaagcttcaagcacgtacgggtgttgcaactcgaagL2 上遊弓丨物ttaagaagcttgcaggcggtacagggacggaagatL2 下遊弓I物:tttgagatctgattctctagaagtggcagctgtL3 上遊弓I物:tcacttctagagaatcagatctcaaatttggaacaatL3 下遊引物ttttctaga￡c￡gcc￡ct38 ；b.將Ll片段經酶切後與真核表達載體連接，再轉化至大腸桿菌中獲得亞克隆質粒 PLl，再將經PLl質粒與L2片段經酶切後連接轉化為質粒PL2，再將質粒PL2與L3片段經酶切後連接轉化，獲得含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒；c.將b所得到的含Li、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒轉染至非洲綠猴腎細胞宿主細胞，得到EV711型感染性克隆。
2.根據權利要求1所述的腸道病毒71型感染性克隆的構建方法，其特徵在於所用真核表達載體為pcDNA3. 1 (+)，所用的大腸桿菌為JM109 ；所得到的三個亞克隆質粒分別是pPLl 質粒、PPL2質粒和pPL3質粒；所得到的含L1、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒為pPev3. 1(+)重組質粒。
3.由權利要求2所得到的全基因組cDNA克隆的重組質粒為pPev3.1 (+)重組質粒。
全文摘要
本發明公開一種腸道病毒71型感染性克隆及其構建方法。本發明的腸道病毒71型感染性克隆的構建方法是從EV17病毒毒株提取的RNA為模板，用下述三對引物分別擴增出L1、L2和L3三個片段；再將L1片段經酶切後與真核表達載體連接，再轉化至大腸桿菌中獲得亞克隆質粒PL1，再將經PL1質粒與L2片段經酶切後連接轉化為質粒PL2，再將質粒PL2與L3片段經酶切後連接轉化，獲得含L1、L2和L3片段的全基因組cDNA克隆的重組質粒；再將重組質粒轉染至非洲綠猴腎細胞宿主細胞，得到EV711型感染性克隆。
文檔編號C12N7/00GK102212554SQ20111008225
公開日2011年10月12日 申請日期2011年4月24日 優先權日2011年4月24日
發明者劉湘濤, 曹偉軍, 李建強, 楊帆, 王玉琳, 鄭海學 申請人:中國農業科學院蘭州獸醫研究所