狹顱田鼠dna序列的製作方法
2023-09-19 04:51:05
狹顱田鼠dna序列的製作方法
【專利摘要】本發明公開了狹顱田鼠DNA序列。本發明為了提供一種快速鑑定狹顱田鼠的方法，通過形態特徵的鑑定方法對該鼠種進行了鑑定，並獲取了該種的COI基因序列。本發明還提供一種用於檢測狹顱田鼠的DNA標準基因、其引物及其試劑盒。本發明採用傳統的形態學鑑定與分子分類方法相結合，對所述狹顱田鼠進行鑑定，可確保物種鑑定的準確性和可靠性。
【專利說明】狹顱田鼠DNA序列
【技術領域】
[0001]本發明涉及狹顱田鼠種類分子鑑定，具體涉及狹顱田鼠DNA序列。
【背景技術】
[0002]狹盧頁田鼠(Microtus gregalis)隸屬於倉鼠科(Cricetidae),田鼠屬(Microtus)。狹顱田鼠多數為小型鼠類，棲息於草原地區，群居；國外分布於俄羅斯、蒙古；國內分布於新疆、內蒙古、河北、山西等地。狹顱田鼠數量多時可危害草原，降低草地產量。狹顱田鼠可傳播鼠疫、土拉倫斯病及蜱性斑疹傷寒等疾病。
[0003]長期以來，對鼠類的鑑定主要依靠形態學特徵來實現，但近幾年，隨著DNA測序等技術的進步，人們陸續採用分子生物學方法對鼠類的DNA進行研究，以期建立新的分類方法，與傳統分類方法相互作證。
[0004]線粒體COI基因是鼠類鑑定研究中應用最為廣泛的分子標記，就目前而言，鼠類分子鑑定研究在國內研究較少，本發明意在提供一種快速鑑定狹顱田鼠的方法。
【發明內容】
[0005]本發明的目的在於提供狹顱田鼠的DNA序列。狹顱田鼠DNA序列的獲得，可為該種的快速鑑定提供科學依據。
[0006]為實現上述目的，本發明通過如下技術方案實現:
[0007]通過試劑盒提取滿洲裡地區的狹顱田鼠的DNA序列，然後由合成的引物擴增該狹顱田鼠的COI基因，PCR產物序列送由專業生物公司測定。測序結果通過手工校對，並用Mega4.0軟體進行相似性分析，確保所得序列為目標序列。所述狹顱田鼠的COI基因序列如SEQ ID No:1 所示。
[0008]本發明提供一種用於檢測狹顱田鼠的DNA標準基因，其特徵在於該基因為COI基因，具有如SEQ ID NO:1所不的基因序列。
[0009]本發明還提供一種檢測狹顱田鼠的DNA標準基因的引物，其特徵在於該引物序列為:
[0010]正向引物5 』 ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA3 』 ；
[0011]反向引物5 』 CCTACTCRGCCATTTTACCTATG3 』。
[0012]本發明還提供一種用於檢測狹顱田鼠的試劑盒，其特徵在於包括上述的引物。
[0013]本發明還提供一種狹顱田鼠的分子鑑定方法，包括:
[0014]1)從待測的鼠類肝臟中分離提取DNA ；
[0015]2)以該DNA為模板，採用上述引物進行擴增；
[0016]3)鑑定擴增所得序列，如果該序列與SEQ ID NO:1的同源性在98%以上，即可判斷所測田鼠為狹顱田鼠。
[0017]本發明還提供一種狹顱田鼠的分子鑑定方法，其中步驟2)中:
[0018]採用聚合酶鏈式反應擴增模板。[0019]本發明還提供一種狹顱田鼠的分子鑑定方法，其中步驟3)中:
[0020]所述鑑定包括取適量步驟2)擴增出的產物用瓊脂糖電泳分離，經染色劑Goldview染色後於凝膠成像系統檢測，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性擴增出720bp左右的條帶，則進行測序分析。
[0021]本發明還提供一種狹顱田鼠的分子鑑定方法，其中擴增體系為:
[0022]
【權利要求】
1.一種用於檢測狹顱田鼠的DNA標準基因，其特徵在於該基因為COI基因，具有如SEQID NO:1所不的基因序列。
2.一種檢測權利要求1所述基因的引物，其特徵在於該引物序列為: 正向引物 5』 ACTTCTGGGTGTCCAAAGAATCA3』 ； 反向引物 5』 CCTACTCRGCCATTTTACCTATG3』。
3.一種用於檢測狹顱田鼠的試劑盒，其特徵在於包括權利要求2所述的引物。
4.狹顱田鼠的分子鑑定方法，包括: O從待測的鼠類肝臟中分離提取DNA ； 2)以該DNA為模板，採用權利要求2所述引物進行擴增； 3)鑑定擴增所得序列，如果該序列與SEQID NO:1的同源性在98%以上，即可判斷所測田鼠為狹頡田鼠。
5.權利要求4所述的分子鑑定方法，其中步驟2)中: 採用聚合酶鏈式反應擴增模板。
6.權利要求4或5所述的分子鑑定方法，其中步驟3)中: 所述鑑定包括取適量步驟2)擴增出的產物用瓊脂糖電泳分離，經染色劑Goldview染色後於凝膠成像系統檢測，根據擴增產物的大小判定結果，如果能特異性擴增出720bp左右的條帶，則進行測序分析。
7.權利要求4或5所述的分子鑑定方法，其中擴增體系為:
模板3-4,uL
正向引物 2pL
反向引物 2pL
Premix25μΙ.ddH O17-18μ[。
8.權利要求4或5所述的分子鑑定方法，其中擴增反應程序為: 預變性94°C 5min，35個循環，其中變性94°C 30s、退火55°C 40s、延伸72°C 60s，最後延伸 72°C IOmin0
9.權利要求6所述的分子鑑定方法，其中: 取5μ L PCR擴增產物，用1%瓊脂糖凝膠電泳，130V電壓，電泳35min，染色劑Goldview染色，凝膠成像系統檢測。
10.一種快速鑑定狹顱田鼠的方法，其特徵在於: 採用傳統的形態學鑑定與權利要求4-9任一項所述的分子鑑定方法相結合。
【文檔編號】C12N15/11GK103695546SQ201310701606
【公開日】2014年4月2日 申請日期:2013年12月18日 優先權日:2013年12月18日
【發明者】張曉龍, 姚李四, 慈穎, 喬舜, 王海玲, 房健慧, 田麗, 魏懷波 申請人:中國檢驗檢疫科學研究院