一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法
2023-09-18 15:20:15 1
專利名稱：一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法
技術領域：
本發明涉及一種多藥耐藥細胞建立的新方法，尤其涉及一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法。
背景技術：
惡性腫瘤是目前危害人類健康的主要疾病指引，其死亡率僅次於心腦血管疾病。目前全世界每年惡性腫瘤的新發病例超過1000萬。在我國，每年新發病例160萬，死亡140萬。膽管癌以前曾經被認為是一種少見疾病，但是隨著各種新的診斷技術的不斷出現，其發病率逐年上升，已經成為消化道腫瘤中上升速度最快的腫瘤之一。目前國內的發病率為O. 1%0 -O. 73%。，發病年齡多在50-70歲，男女比例約為I. 4:1，而國外屍檢發現率為
O.01%-0· 5%。根據Mouzas IA等調查發現從1992年到2000年的9年時間裡，膽管癌的發病率從O. 998/10萬一2. 329/10萬一3. 327/10萬人，漸呈上升趨勢。膽管癌早期發現率低，大多數患者發現時已失去手術機會，而且手術切除率較低，一般為50%左右，，除了少數的早期病變之外，一般很難通過手術達到根治性切。隨著科學技術的發展，雖然手術切除治療上雖然得到較大的進展，手術切除率已明顯提高，手術死亡率也明顯下降，手術方法亦日趨規範化，但存在的困難仍然很多，由於真正能達到根治性切除的病例很少，腫瘤復發常常是難以避免的。遠期效果仍不佳，需有新的突破。現有的化學藥物治療未見有明顯的效果，而且在化療過程中易出現耐藥。放射治療儘管部分病人能延長生存時間，但仍然很難提高病人的生活質量。目前尚缺乏早期診斷膽管癌的手段，對膽管癌的發病機制的了解也不夠深入。進一步提高對膽管癌病因、發病機理、早期診斷以及相應的治療方法的認識，對於延長患者生命，改善患者生活質量，甚至治癒膽管癌有重要意義。因此，通過對建立的膽管癌細胞系的進一步研究勢在必行。
發明內容
本發明的目的在於提供一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，建立膽管癌耐藥細胞株。本發明的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法包括以下步驟
O將膽管癌細胞株QBC939放入含表皮生長因子濃度為5-15μ8/πι1，藥物濃度為
O.0005-0. 002 μ g/ml的培養液中培養2-4天；
2)棄去藥物培養液，將步驟I)處理後的管癌細胞株QBC939放入含表皮生長因子5-15 μ g/ml，藥物濃度增加的培養液中培養2-4天；
3)重複步驟2)，直到藥物濃度為O.25-0. 3 μ g/ml ；
4)棄去藥物培養液，將步驟3)處理後的管癌細胞株QBC939放入含表皮生長因子5-15 μ g/ml，藥物濃度降低的培養液中培養2-4天；
5)棄去藥物培養液，將步驟4)處理後的管癌細胞株QBC939放入含表皮生長因子5-15 μ g/ml，藥物濃度增加的培養液中培養2-4天；
6)重複步驟5)，直到藥物濃度比步驟3)的藥物濃度高O.1-1 μ g/ml ；
7)重複步驟4)、步驟5)和步驟6)，每次重複後藥物濃度均比上一次重複後的藥物濃度高O. 1-1 μ g/ml,直到藥物濃度為O. 8-1. 5 μ g/ml為止。上述步驟中，優選地，增加藥物濃度每次增加O. 004-0. 25 μ g/ml,降低藥物濃度每次降低 O. 1-0. 25 μ g/ml O優選地，膽管癌細胞株在培養液中每次培養3天。優選地，所述表皮生長因子的濃度為10 μ g/ml ο所述藥物可以為氮芥、環磷醯胺、博萊黴素、長春新鹼、平陽黴素、優福啶、哺氟啶或多柔比星等中的任意一種或幾種。本發明的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法採用藥物濃度遞增結合高低濃度交替作用合併生長因子刺激法，能提高培養效率，相對於藥物濃度遞增刺激法，在較短時間內就能建立膽管癌耐藥細胞株，可用於分析得到膽管癌細胞化療耐藥後的形態學及生物學習性的變化，篩選得到的化療藥物及判斷得出化療藥物的敏感性，分析得到的腫瘤化療多藥耐藥機制，體外篩選得到的耐藥逆轉劑更具有代表性、針對性、可靠性和廣譜性。·
具體實施例方式下面結合具體實施例對本發明所述的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法進行詳細的介紹和描述，以更好的理解本發明，但是應當理解的是，下述實施例並不限制本發明範圍。本實施例中採用藥物多柔比星(ADM)，依照本發明的方法，建立膽管癌耐藥細胞株QBC939/ADM，具體包括以下步驟
1)將膽管癌細胞株QBC939放入含表皮生長因子濃度為10μ g/ml, ADM濃度為O. 001μ g/ml的DMEM培養液中培養3天；更換培養液，膽管癌細胞株QBC939按順序分別在含表皮生長因子濃度為 10 μ g/ml, ADM 濃度為 O. 005 μ g/ml>0. 01 μ g/ml>0. 05 μ g/ml、0. Iμ g/ml和O. 25 μ g/ml的DMEM培養液中各培養3天；
2)更換培養液，步驟I)獲得的膽管癌細胞株QBC939按順序分別在含表皮生長因子濃度為 10 μ g/ml, ADM 濃度為 O. I μ g/ml,O. 25 μ g/ml 和 O. 5 μ g/ml 的 DMEM 培養液中各培養3天；
3)更換培養液，步驟2)獲得的膽管癌細胞株QBC939按順序分別在含表皮生長因子濃度為 10 μ g/ml，ADM 濃度為 O. 25 μ g/ml、O. 5 μ g/ml 和 O. 75 μ g/ml 的 DMEM 培養液中各
培養3天；
4)更換培養液，步驟3)獲得的膽管癌細胞株QBC939按順序分別在含表皮生長因子濃度為10 μ g/ml, ADM濃度為O. 5 μ g/ml,O. 75 μ g/ml和I μ g/ml的DMEM培養液中各培養3天，最終獲得能在I. O u g/ml ADM中生長的QBC939耐藥細胞株。本實施方式採用的方法可以防止細胞死亡過快、培養交率低的情況，提高了培養效率，只需3個多月就建立了具有多藥耐藥性的QBC939/ADM細胞。對本實施方式建立的具有多藥耐藥性的QBC939/ADM細胞進行細胞生物學性檢測，結果如下I.耐藥細胞的形態變化
當ADM濃度在O. I μ g/ml以下時，細胞形態與親本細胞比較，未見明顯變化;ADM濃度在O. 5 μ g/ml以上時，細胞形態發生變化，光鏡下可見梭形，多邊形，橢圓形，不規則形的多核巨細胞，細胞核大呈卵圓形、不規則型、雙核型。核染色質粗，細胞質少；iQBC939細胞能在I μ g/ml ADM的培養液中穩定生長並傳代時，將其定名為QBC939/ADM。倒置顯微鏡下對數生長期的膽管癌QBC939/ADM細胞呈鋪石狀鑲嵌緊密排列，細胞呈多邊形、梭形、三角形等各種形態，以三角形為主生長活躍。2.倍增時間(Td)的測定
QBC939細胞Td為27小時，QBC939/ADM的Td為31小時，延長了 4小時，增加I. 15倍。3耐藥譜分析(MTT法)
三種化療藥對QBC939/ADM細胞株的抑制作用明顯降低。與親本細胞株相比，QBC939/ADM細胞株對多柔比星(ADM)、絲裂黴素(MMC)、長春地辛(VDS)分別產生不同程度的耐藥(表 I)。表-IADM、MMC, VDS 對膽管癌 QBC939
權利要求
1.一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，其特徵在於，包括以下步驟 1)將膽管癌細胞株放入含表皮生長因子濃度為5-15μ g/ml，藥物濃度為O. 0005-0. 002μ g/ml的培養液中培養2-4天； 2)棄去藥物培養液，將步驟I)處理後的膽管癌細胞株放入含表皮生長因子5-15μ g/ml，藥物濃度增加的培養液中培養2-4天； 3)重複步驟2)，直到藥物濃度為O.25-0. 3 μ g/ml ； 4)棄去藥物培養液，將步驟3)處理後的管癌細胞株放入含表皮生長因子5-15μg/ml，藥物濃度降低的培養液中培養2-4天； 5)棄去藥物培養液，將步驟4)處理後的管癌細胞株放入含表皮生長因子5-15μg/ml，藥物濃度增加的培養液中培養2-4天； 6)重複步驟5)，直到藥物濃度比步驟3)的藥物濃度高O.1-1 μ g/ml ； 7)重複步驟4)、步驟5)和步驟6)，每次重複後藥物濃度均比上一次重複後的藥物濃度高O. 1-1 μ g/ml,直到藥物濃度為O. 8-1. 5 μ g/ml為止。
2.根據權利I所述的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，其特徵在於，增加藥物濃度每次增加O. 004-0. 25 μ g/ml ο
3.根據權利I所述的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，其特徵在於，降低藥物濃度每次降低O. 1-0. 25 μ g/ml。
4.根據權利I所述的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，其特徵在於，膽管癌細胞株在培養液中每次培養3天。
5.根據權利要求I所述的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，其特徵在於，所述表皮生長因子的濃度為10 μ g/ml0
6.根據權利要求I所述的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法，其特徵在於，所述藥物為氮芥、環磷醯胺、博萊黴素、長春新鹼、平陽黴素、優福啶、哺氟啶或多柔比星中的任意一種或幾種。
7.—種如權利要求I所述方法建立的多藥耐藥膽管癌細胞。
全文摘要
本發明的一種人膽管癌多藥耐藥細胞建立的新方法採用藥物濃度遞增結合高低濃度交替作用合併生長因子刺激法，能提高培養效率，相對於藥物濃度遞增刺激法，在較短時間內就能建立膽管癌耐藥細胞株，可用於分析得到膽管癌細胞化療耐藥後的形態學及生物學習性的變化，篩選得到的化療藥物及判斷得出化療藥物的敏感性，分析得到的腫瘤化療多藥耐藥機制，體外篩選得到的耐藥逆轉劑更具有代表性、針對性、可靠性和廣譜性。
文檔編號C12N5/09GK102911917SQ20121042277
公開日2013年2月6日 申請日期2012年10月30日 優先權日2012年10月30日
發明者劉志華, 秦環龍, 汪建平 申請人:劉志華