一種分離純化分子重組用膠原蛋白的方法

2023-09-18 17:34:35 1

專利名稱：一種分離純化分子重組用膠原蛋白的方法
技術領域：
本發明屬於膠原蛋白的技術領域，具體涉及一種分子重組用膠原蛋白的分離純化方法。
背景技術：
膠原蛋白是存在於細胞間質的結構蛋白質，廣泛分布於動物結締組織中。膠原蛋白構 成的膠原纖維使動物結締組織具有良好的彈性、延展性和韌性。由於膠原蛋白具有易於設 計和修飾的基本單元胺基酸、沒有細胞毒性、可調控的生物降解速度、能特異促進或抑制 細胞-材料的相互作用、能引發的免疫反應和炎症最小、容易純化和處理、與水溶液和生理 條件的生物化學相容性優良等諸多優點。在組織工程領域自然生物材料膠原蛋白具有廣闊 的應用前景，從海洋生物的結締組織如皮膚等組織獲取的膠原蛋白與陸地生物來源的膠原 蛋白相比又具有最大限度的生物安全性，所以，海洋生物膠原蛋白是作為生物醫藥材料的 最佳天然材料。
膠原蛋白作為生物醫學材料有顯著的功能特性，但也存在不足，通過物理交聯、化學 試劑交聯和通過與其它高分子材料共混等方法保持膠原蛋白生物活性的同時,並賦予新的 功能，近幾年將不同天然高分子進行共混雜化形成的複合材料顯示出了其它材料無法替代 的優點和性能,是目前研究和開發生物材料的熱點。
圍繞著保持膠原蛋白的天然分子結構和分子重組用生物材料的安全性，發明者確定了 在溫和條件下分離鯊魚頭皮膠原蛋白的製造工藝並且表徵了分子重組用膠原蛋白的特性。

發明內容
本發明的目的是提供一種分子重組用膠原蛋白分離純化方法，使製備獲得的膠原蛋白 能較好的維持天然存在的膠原蛋白的空間結構特徵，經分子重組後，能製成抗滲漏性好、 降解時間長的生物醫學工程材料，可作為靜動脈血管再造等要求較高的各類醫療手術材 料。
本發明以鯊魚頭皮為材料，通過不同濃度的緩衝液依次浸泡、鹽析、層析等方法提取 和純化膠原蛋白，具體步驟如下
將鯊魚頭皮用濃度為10-20mmol/L、 pH值為7.4-7.6的磷酸緩衝液浸泡、衝洗，去掉 鱗和殘肉，切成(0.3-0.6cm)x(0.3-0.6cm)小塊；再用去離子水浸泡衝洗，清洗乾淨的鯊魚頭 皮用濃度為50-100mmol/L、 pH值為7.4-7.6的磷酸緩衝液浸泡處理50-80小時，勻漿；低
溫(2°C-8°C)中速G000-5000r/min)離心，取上清液。上清液用高飽和度硫酸銨鹽析， 低溫中速(同前)離心，保留沉澱物。將沉澱物溶在濃度為150-250mmol/L、 pH值為6.8-7.2 的磷酸緩衝液中。用葡聚糖凝膠層析，收集蛋白洗脫液，濃縮，再真空冷凍乾燥，即得所 需膠原蛋白。本發明具有以下優點1、 具有較低的價格。作為下腳料的鯊魚頭皮作為膠原蛋白提取的原料，原料豐富， 價格低廉。2、 最大限度維持了天然膠原蛋白的結構特徵，獲得的膠原蛋白具有最高的生物安全性。3、 有利於分子重組的進行。4、 所得鯊魚頭皮膠原蛋白能溶於中性及酸性溶液中，較之其他來源的膠原蛋白有更大 的溶解性，能應用於更多領域。5、 製備分子重組用膠原蛋白的工藝不會汙染環境。 本發明原料也可以採用鯊魚其他部位的皮膚。
具體實施方式
在溫和的提取條件下，以青鯊頭皮為原料分離純化分子重組用膠原蛋白的方法如下(1) 將冰凍保存的青鯊頭皮30g用磷酸鹽緩衝液(10mM,pH7.4-7.6)浸泡衝洗去掉鱗 和殘肉，切成0.5 cmXO.5 cm小塊，再用去離子水浸泡衝洗3 5次。(2) 清洗乾淨的魚皮用磷酸鹽緩衝液250ml(100mM,pH7.4-7.6)浸泡72小時，然後 勻槳5 min， 4°C 、 10000rpm離心15 min，取上清液。(3) 沉澱重複(2)的過程一次，合併上清液，加硫酸銨至飽和度70%-80%，離心(8000 卬m，4'C, 15min)，保留沉澱物。(4) 將沉澱物溶在約20 ml磷酸鹽緩衝液(200 mM, pH7.0,1.5 g/ml)中。(5) 以磷酸鹽緩衝液(200mM,pH7.0)為洗脫液，用葡聚糖G-150層析上述溶解液， 收集蛋白洗脫液，濃縮，真空冷凍乾燥後得到分子重組用膠原蛋白。經上述分離、純化的青鯊頭皮膠原蛋白在濃縮膠4-5%、分離膠7.5-8%的SDS-PAGE 上只體現清晰的三條譜帶，三條譜帶的分子量從低到高分別是118 kDa, 134 kDa和205 kDa。從青鯊頭皮分離到的膠原蛋白的變性溫度是47.2rC。從青鯊頭皮分離的膠原蛋白其 二級結構以e-摺疊為主，並包含有無規巻曲。該膠原蛋白的分子重組材料能作為靜動脈血 管再造等要求較高的醫療手術材料。分子重組膠原蛋白的製備方法如下
將由上述方法製備的膠原蛋白0.8 - 1.0g，溶於45 -55 ml濃度為2.5 - 3.5 mg/ml 1-乙 基-3-(3-二甲丙氨基)碳化二醯亞胺和5.4 - 5.8 mg/m賠基琥珀醯亞胺的pH值為5 - 6溶液 中，室溫保持2-2.5小時，完成交聯化。離心(3000-4000 rpm， 5-6 min,室溫)之後， 除去上清液，添加50-55mlNa2HPO4(0.1-0.15M)室溫保持2-2.5小時。用上述條件離 心，除去上清液，用無離子水清洗3次，真空冷凍乾燥，獲得分子重組膠原蛋白。
權利要求
1、一種分離純化分子重組用膠原蛋白的方法，其特徵在於具體步驟如下將鯊魚頭皮用濃度為10-20mmol/L、pH值為7.4-7.6的磷酸緩衝液浸泡、衝洗，去掉鱗和殘肉，切成(0.3-0.6cm)×(0.3-0.6cm)小塊；再用去離子水浸泡衝洗，清洗乾淨的鯊魚頭皮用濃度為50-100mmol/L、pH值為7.4-7.6的磷酸緩衝液浸泡處理50-80小時，勻漿；低溫2℃-8℃中速3000-5000r/min離心，取上清液；上清液用高飽和度硫酸銨鹽析，低溫2℃-8℃中速3000-5000r/min離心，保留沉澱物；將沉澱物溶在濃度為150-250mmol/L、pH值為6.8-7.2的磷酸緩衝液中，用葡聚糖凝膠層析，收集蛋白洗脫液，濃縮，再真空冷凍乾燥，即得所需膠原蛋白。
2、 一種如權利要求1所述方法製備的分子重組膠原蛋白。
3、 一種分子重組膠原蛋白的製備方法，其特徵在於具體步驟如下將由權利要求1所述方法製備的膠原蛋白0.8-1.0g，溶於45-55ml濃度為2.5-3.5mg/ml 1-乙基-3-(3-二甲 丙氨基)碳化二醯亞胺和5.4 - 5.8 mg/ml羥基琥珀醯亞胺的pH值為5 - 6溶液中，室溫保持2 -2.5小時，完成交聯化；室溫下離^3000-4000 rpm/min, 5-6 min;除去上清液，添加 50-55ml濃度為0.1-0.15M的Na2HP04，室溫保持2-2.5小時，用上述條件離心，除 去上清液，用無離子水清洗，真空冷凍乾燥，獲得分子重組膠原蛋白。
全文摘要
本發明屬於膠原蛋白技術領域，具體為一種分離純化重組用膠原蛋白的方法。本發明以鯊魚頭皮為原料，依次進行不同濃度的磷酸緩衝液浸泡、鹽析和層析，提取並純化膠原蛋白。獲得的膠原蛋白能較好的維持天然存在的膠原蛋白的空間結構特徵，經分子重組後，能製成抗滲漏性好、降解時間長的生物醫學工程材料，可作為靜動脈血管再造等要求較高的各類醫療手術材料。本發明方法原料豐富，價格低廉，工藝簡單，無環境汙染。
文檔編號C07K1/36GK101157719SQ200710047700
公開日2008年4月9日 申請日期2007年11月1日 優先權日2007年11月1日
發明者斌 包, 吳文惠, 豔 張, 朱夕波, 燕 李, 王南平, 繆輝南 申請人:上海水產大學