丹參酮類化合物的抗腫瘤用途的製作方法

2023-09-16 02:13:10 1

專利名稱：丹參酮類化合物的抗腫瘤用途的製作方法
技術領域：
本發明屬於植物藥用成分和抗腫瘤化合物領域，特別涉及的是從中藥丹參 (Salvia miltiorrhiza Bge.)中提取的具有明顯預防和治療腫瘤作用的有效成分丹參酮 類化合物及其應用。
背景技術：
目前全世界每年有數百萬人死於癌症，新發病例還在逐年增加。我國13億人口中 每年有百萬人死於癌症，癌症已成為第一位死因。 目前，化療及放療為治療癌症的首選，但對腫瘤細胞的特異性較差因而具有較大 的毒副作用以及某些腫瘤細胞對化療和放療處理的不敏感，因此在很大程度上限制了它們 在臨床中的應用。近年來，為了開發出能特異性地殺傷癌細胞而對正常細胞毒負作用較小 的藥物。因此，研究製備新的抗腫瘤藥物成為生物醫藥領域的熱點。 丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)為唇形科丹參屬植物，為一常用中藥。現代 藥理學研究表明丹參提取物具有抗腫瘤作用，其中主要研究了丹參酮IIA的抗非小細胞肺 癌、乳腺癌的作用，很少報導其它丹參酮類化合物的抗腫瘤作用。

發明內容
本發明的目的是提供一種丹參酮類化合物在製備抗腫瘤藥物中的應用，所述丹參
酮類化合物具有以下結構通式
o 其中，&可以為H、 CH3、 CH2CH3、 CH2CH = C (CH3) 2、 0H、 0CH3、 NH2、 = 0、 A1'2等取代基 的任一種；R2可以為=CH2、CH3、 (CH3)2等取代基團中的任一種。主要涉及以下4種化合物
4
l(丹參新酮) 2(1-oxomiltirone)
3(4-methylenemiltirone) 4(1，2-didehydromiltirone) 本發明的化合物所述的抗腫瘤包括腦瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、 宮頸癌、胃癌、食道癌等。 本發明的化合物也可以用於製備癌症化學預防藥物、抗炎藥物及抑制腫瘤血管生 成的藥物。 以MTT法進行抗腫瘤作用的篩選，結果顯示，本發明的丹參酮類化合物處理的腫 瘤細胞系如人髓白血病細胞(HL60)、腦膠質瘤細胞(U87)、乳腺癌細胞(MCF-7)、肺癌細胞 (H460)、人肝癌細胞(H印G2)、人前列腺細胞(PC3)、人結腸癌細胞(SW480)、人宮頸癌細胞 (Hela)隨著用藥濃度增高與相應不加藥對照組相比細胞增殖活性分別下降了，說明化合物 呈濃度依賴性抑制腫瘤細胞增殖。 以MTT法進行癌症化學預防的篩選，結果顯示，本發明的丹參酮類化合物能顯著 誘導醌還原酶的表達。 以官腔形成法進行腫瘤血管生成抑制作用研究，結果顯示，本發明的丹參酮類化 合物能顯著抑制腫瘤血管生成的作用。 本發明的化合物可與市售或者常用的載體結合，用於預防或者治療腫瘤和癌症。 所述的藥物可以為片劑或者針劑。 本發明經實驗證明，所述丹參酮類化合物為有效的抗腫瘤劑。本發明用乙醇、氯 仿、甲醇和矽膠等低廉、常見的試劑從中藥材中分離得到丹參新酮類化合物單體，該方法簡 單可靠，成本低，效率高，可進行工業化大生產，有利於推廣應用。


圖1為丹參酮類化合物1的腫瘤血管抑制試驗結果。
5
圖2為丹參酮類化合物2的腫瘤血管抑制試驗結果。
圖3為丹參酮類化合物3的腫瘤血管抑制試驗結果。
圖4為丹參酮類化合物4的腫瘤血管抑制試驗結果。
具體實施例方式以下通過具體的實施方式的實施例對本發明的內容作進一步詳細的說明。但不應 將實施例理解為對本發明的限制。在不脫離本發明上述思想情況下，根據本領域普通技術 知識和常規手段作出的各種替換手段或變更，均包含在本發明之內。
實施例1化合物1-4的製備 丹參藥材(3kg)用8倍量的95%乙醇提取3次，乙醇提取物以石油醚、二氯甲烷、 正丁醇依次萃取。將二氯甲烷層(70g)溶於100mL乙酸乙酯，加70g200-300目層析矽膠拌 樣。以300g 200-300目層析矽膠溼法裝柱，將樣品加入，固定柱子。用石油醚衝洗柱子，
直到柱子內充滿液體後換上石油醚乙酸乙酯(ioo : i)流動相進行洗脫。分別以石油 醚乙酸乙酯ioo : i，50 : i，20 : i，i6 : i，io : i，8 : i，6 : i，4 : i，3 : 1，2 : i， 1.5 : i，i : i，i : i.5，i : 2，i : 3，i : 5，i : io，i : so進行洗脫，每個梯度洗脫容積
為1.6L，分成4瓶，每瓶400mL。將所得溶液濃縮，濃縮液轉移至10mL青黴素瓶，點板分析
後將相同樣品進行合併。對石油醚乙酸乙酯8 : i洗脫的部分進行分離，主要分離方法
為反相製備液相。以梯度乙腈/水60min內從50%-93%進行洗脫，26. 3min得2，46. 5min 得1，40min得4，3(再以77%乙腈等度洗脫純化)。其NMR數據分別參見表1和表2。
表1化合物1和2的核磁共振氫譜和碳譜數據(CDC13，力，500MHz， 13C， 125MHz)
_^__^￡__
1 29.3 3.04(2H,t,聲7.0Hz) 198.8 —218.61.71 (2H,m)36.62.90 (2H， t, J-8.0 Hz)
37.41.59 (2H,m)34.92.06 (2H, t， Hz)
434.0——36.1一
5148,7—153.8一
6133.77.74 (1H, d，風5Hz)130.97.26 (1H, d, J"=8.5 Hz)
"7128.27.36 (1H, d， 《/=8.5 Hz)135.57.63 (m， d,J=8,5Hz)
8142.5—130.0一
9127.9一131.9一
10143.9_132.8一
11181.6—183.8一
12]80.5—183.1一
13134.1—146.5一
14139.57.36 (1H， s)137.87.07 (1H, s)
1526.42.87 (1H， m)27.02.33 (1H， m)
1621.21.12(3H,d,6.5Hz)21.51.33 (3H, s)
1721.2U2(3H， d，J-6.5 Hz)21.51.33 (3H，s)
1831.31.26 (3H, s)28.81.16 (3H, s)
1931.31.26(3H, s)28.8U7(3H, s) 表2化合物3和4的核磁共振氫譜和碳譜數據(CDC13，力，500MHz， 13C， 125MHz)
132.23.28 (2H， t， J=6,5 Hz)124.77.11 (m， d,".5 Hz)
223.33.03 (2H, m)129.26.33 (1H， m)
329.42.35 (2H， m)38.02.23 (2H, dd,4.0 Hz)
4145.5—34.0一
5138.1—148.0一
6131.17.12 (1H， d，風OHz)130,67.86 (1H, d, J^7.5 Hz)
7127.97.85 (1H, d, >8.0 Hz)134.47.50 (1H， d， 《/=7.5 Hz)
8144.7—137.3一
9128.4一124.6一
10136.1_134.3一
11181.4_183.2一
12182.3一181.6一
13143.2一145.0一
14139.77.10 (1H， s)140.07.09 (1H， s)
1527.01.91 (1H, m)26.93.02 (1H， m)
1621.51.19 (3H， d,風5 Hz)21.51.17 (3H, d,/=7.0 Hz)
1721,51.19 (3H, d,^6.5Hz)21.51.17 (3H， d,乂:7.0Hz)
18110.35,49 (1H, s), 5.06 (1H， s)28.31.25(3H, s)
19一一28.31.25 (3H， s) 實施例2化合物1-4的體外抗腫瘤作用實驗 取對數期的細胞每孔3X 104接種於96孔板上，12h後，棄上清，按以下分組給藥 正常對照組和加藥組(濃度0-100 ii M)，每組設6個復孔，培養24h，棄上清，加入帶MTT的培養液50 ii 1培養4h (0. 5mg/mL)，加入100 y 1 DMS0，振蕩lh，於酶標儀上570nm處測0D值。
結果顯示，加藥後，腫瘤細胞活性明顯下降，而且腫瘤細胞活性隨著藥物濃度的增 加而降低。結果詳見表3。 PC3(前列腺癌細胞)、U87(腦膠質瘤細胞)、Hela(宮頸癌細 胞)、SGC-7901 (胃癌細胞)，上述細胞株均購自中科院上海細胞生物研究所。
表3為丹參酮類化合物1-4的體外抗腫瘤試驗結果。
化合物IC50(pg/mL)
PC3U87HelaSGC-7卯1
10.74 ± 0.070.50 ±0.090.11 ±0.031.89 ±0.08
20.23± 0.050.02± 0.010.10 ±0.011.04 ±0.12
3U6±0.130.36 ±0.090.25 ± 0.071.59 ±0.09
40.37 ±0.080.21 ±0.100.19 ±0.031.37±0.16
紫杉醇0.0620.045O細0.059 實施例3化合物1-4的醌還原酶誘導實驗 取對數期的H印a lclc7細胞，每孔2Xl(^接種於96孔板上，24h後，棄上清，按一 下分組給藥正常對照組和加藥組(濃度0-100yM)，每組設6個復孔，培養24h，棄上清，加 入洋地黃皂苷使細胞裂解，後加入帶MTT的培養液200 1培養5min (0. 5mg/mL)，於酶標儀 上550nm處測OD值。 結果參見表4，表4顯示，加藥後，藥物能明顯誘導醌還原酶的表達，所述細胞均購 白ATCC。 表4丹參新酮類化合物1-4的醌還原酶誘導結果。
化合物醌還原酶誘導活性CD(昭/mL) ± SD (Heap lclc7)
10.92±0.21
20.40±0.08
31.04±0.17
40.46±0.15
4'-溴黃酮0.26±0.12 實施例4丹參酮化合物1-4的腫瘤血管生成抑制實驗 製做加藥板分別取DMSO溶解的丹參酮儲備液(0， 1， 2X 200 ii M) 10 ii L於96孔板 中，每孔再加190iiL PBS稀釋，混勻。備用。 1.鋪膠取45 ii L GFR-Matrigel於預冷的96孔板中(45 ii L/wel1)，振動使其鋪 平，勿引入氣泡。37t:培養箱中放置10min。取出待用。 2.配製細胞懸液取EAhy926細胞，消化，用低血清培養基(DMEM，2% FBS， 1%。雙 抗)終止消化，計數，離心，用低血清培養基重懸，配成細胞密度為3X105cell/mL的細胞懸 液。 3.接種在已鋪好膠的96孔板中加入90 ii L低血清細胞懸液，再加入10 y L稀釋 過的各濃度丹參酮藥液。 4.培養將板放入缺氧培養箱(37°C ， 95 % N2， 5 % C02)中連續培養6h。
5.拍照Leica光學顯微鏡下隨機取5個視野拍照。
8
結果顯示，加藥後，藥物能明顯抑制官腔的形成，所述細胞均購自ATCC(參見圖 1-4)。結果顯示，化合物l-4作用於細胞後，隨著化合物濃度的增加，能顯著抑制管腔的形 成，說明具有潛在的腫瘤血管生成抑制作用。
權利要求
一種丹參酮類化合物在製備抗腫瘤藥物中的應用，所述丹參酮類化合物具有以下結構通式其中R1為H、CH3、CH2CH3、CH2CH＝C(CH3)2、OH、OCH3、NH2、＝O、或Δ1，2中的任一種；R2為＝CH2、CH3或(CH3)2中的任一種；具體涉及以下4種化合物1(丹參新酮) 2(1-oxomiltirone)3(4-methylenemiltirone) 4(1，2-didehydromiltirone)F2009101550421C00011.tif,F2009101550421C00012.tif,F2009101550421C00013.tif
2. 根據權利要求1所述的一種丹參酮類化合物製備抗腫瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述的腫瘤包括腦瘤、前列腺癌、宮頸癌或胃癌。
3. 根據權利要求1所述的一種丹參酮類化合物製備抗腫瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述化合物在製備抗炎藥物中的應用。
4. 根據權利要求1所述的一種丹參酮類化合物製備抗腫瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述化合物在製備抑制腫瘤血管生成藥物中的應用。
5.根據權利要求1所述的一種丹參酮類化合物製備抗腫瘤藥物中的應用，其特徵在於，所述化合物在製備醌還原酶誘導劑中的應用。
全文摘要
本發明提供一種丹參酮類化合物在製備抗腫瘤藥物中的應用，所述的抗腫瘤包括腦瘤、肺癌、肝癌、乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、宮頸癌、胃癌、食道癌等。經實驗證明，所述丹參酮類化合物呈濃度依賴性抑制腫瘤細胞增殖。化合物能顯著誘導醌還原酶的表達，能顯著抑制腫瘤血管生成的作用。因此也可用於製備癌症化學預防藥物、抗炎藥物及抑制腫瘤血管生成的藥物。本發明用乙醇、氯仿、甲醇和矽膠等低廉、常見的試劑從中藥材中分離得到丹參新酮類化合物單體，該方法簡單可靠，成本低，效率高，可進行工業化大生產，有利於推廣應用。本發明丹參酮類化合物具有以下結構通式
文檔編號A61P35/00GK101732294SQ20091015504
公開日2010年6月16日 申請日期2009年12月14日 優先權日2009年12月14日
發明者孫芳, 馬忠俊 申請人:浙江大學