蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法
2023-09-16 02:47:45 1
專利名稱：蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法
技術領域：
本發明涉及一種分離方法，尤其是涉及一種採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑的等電沉澱雜蛋白分離提純蚓激酶的方法。
背景技術：
蚓激酶(lumbrokinase)是自蚯蚓中提取出來的具有纖溶酶活性的多組分蛋白質的總稱，是目前較有開發前景的纖溶藥物之一。現有文獻表明，蚓激酶是一組分子量為20～40kD、具有激酶和纖溶酶活性的絲氨酸蛋白酶，其中較多活性組分等電點集中在4.0以下。此外，蚯蚓中還含有其他一些生物活性成分，因而採用溫和、環保的辦法分離提純蚓激酶對於其中多種營養和藥物有效成分的分離具有較重要的意義。目前蚓激酶是將新鮮的赤子愛勝蚓搗碎，離心收集上清夜，然後從上清液中鹽析得到沉澱，繼而脫鹽凍幹後的粗加工製品[1]。專利00132716.X公開了一種蚓激酶的分離工藝，包括食鹽處理、洗淨、加緩衝液、製漿、離心、親和層析，離子交換層析等步驟，該過程操作複雜，酶損失量較大。且該分離工藝沒有考慮到蚯蚓中其他活性組分的提取和分離問題。
參考文獻[1]王東鵬，孫貴寶，高活性蚓激酶提取工藝研究，寧夏科技，2001，(6)，44-45發明內容本發明的目的是提供一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法。
方法的步驟如下1)首先，將蚓激酶粗品溶於乙醇-水溶液中，配製粗酶濃度為2～7％(質量百分比)，乙醇濃度為0～40％(體積百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物；2)然後，取20mL上述混合溶液加入到預熱溫度為20～40℃高壓釜中，繼而通入預熱溫度為20～40℃，壓力為3.5～8.5MPa的加壓CO2同時攪拌，調節溶液的pH為4.4，在高壓下保持20～60分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中，再將沉澱分離出去即可。
本發明與傳統等電沉澱方法相比，酶活損失少，同時又比傳統的等電沉澱體系具有較多的優勢，如操作條件比較溫和，且可同時得到蚓激酶粗品中的多種活性成分。另外乙醇的加入可使水溶性較強的蛋白質易於沉澱出來，所加助劑乙醇量較有機溶劑沉澱法要少很多，因而酶活損失很少。採用加壓CO2進行pH的調節可以避免用無機酸等調節溶液pH時酸過量或局部pH過低的情況，減少因此帶來的蛋白質變性。由於CO2在溶液中大多以分子形式存在，這使得溶液離子強度不會因此過多升高，因而比無機酸更適於等電沉澱中的pH調節。本發明解決了現有技術所存在的操作條件苛刻，無法同時得到蚯蚓酶中其它活性成分，酶損失量較大等技術問題，提供了一種操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶活基本無損失的蚓激酶的分離提純方法。本發明還解決了現有技術所存在的操作條件難以精確控制，操作過程波動較大等技術問題，提供了一種操作參數可精確控制，操作過程無波動的一種蚓激酶的分離提純方法。
具體實施例方式
本發明採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術；分離提純步驟包括蚓激酶乙醇-水溶液的配製，用加壓CO2將溶液pH調至所需範圍，過濾沉澱出來的雜蛋白，而蚓激酶仍然存留在濾液中。為實現該過程，首先配製合適濃度的蚓激酶的乙醇-水溶液，然後取適量的溶液加入到高壓釜中，繼而通入加壓CO2，用來調節溶液的pH至所需範圍，由於蚓激酶粗品中的一些無激酶活性蛋白質的沉澱pH在3.0～5.0之間，而在此範圍內蚓激酶類並不沉澱，因而用CO2將溶液pH調至此範圍時，蚓激酶中的無激酶活性蛋白質就會沉澱出來，從而達到分離提純的效果。本發明所採用的加壓CO2-乙醇-水體系用於等電沉澱蛋白質，蚓激酶的分離提純方法的高壓釜預熱溫度和CO2預熱溫度為20～40℃，CO2壓力為3.5～8.5MPa，纖維素酶質量百分比濃度為2～7％，乙醇溶液體積百分比濃度為0～40％，CO2壓力維持時間為20～60分鐘。
下面通過具體實施例，對本發明的技術方案作進一步具體的說明。實施例1稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為30％(體積百分比)，粗酶濃度為4％(質量百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至25℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度25℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至7.0MPa，並調節操作溫度至25℃，此時溶液的pH為4.4，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持40分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為98.6％，該過程的純化倍數2.53。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例2稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為40％(體積百分比)，粗酶濃度為6％(質量百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至25℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度25℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至4.5MPa，並調節操作溫度至25℃，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持55分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為94.1％，該過程的純化倍數2.41。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例3稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為35％(體積百分比)，粗酶濃度為2％(質量百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至20℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度20℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至3.5MPa，並調節操作溫度至20℃，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持30分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為97.9％，該過程的純化倍數1.11。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例4稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為0％(體積百分比)，粗酶濃度為5％(質量百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至40℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度40℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至8.5MPa，並調節操作溫度至40℃，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持20分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為98.1％，該過程的純化倍數1.29。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例5稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為30％(體積百分比)，粗酶濃度為3％(質量百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至35℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度35℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至6.0MPa，並調節操作溫度至35℃，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持60分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為97.6％，該過程的純化倍數1.63。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例6稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為15％，粗酶濃度為7％的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至30℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度30℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至5.5MPa，並調節操作溫度至30℃，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持50分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為97.3％，該過程的純化倍數2.99。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
實施例7稱取適量的蚓激酶粗品配製成乙醇濃度為25％(體積百分比)，粗酶濃度為4％(質量百分比)的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物。然後取20mL的溶液加入到預熱至30℃的高壓釜中。繼而通入預熱溫度30℃的加壓CO2同時攪拌，使壓力增至8.0MPa，並調節操作溫度至30℃，釜內沉澱現象明顯，在高壓下保持35分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中。然後將沉澱分離出來，酶活得率為98.9％，該過程的純化倍數2.61。本方法採用加壓CO2作為揮發性酸，乙醇作為助沉澱劑，形成加壓CO2-乙醇-水體系蛋白質等電沉澱技術，把蚓激酶粗品中的雜蛋白沉澱出來。該方法具有操作條件相對溫和，可以同時得到其它活性組分，酶基本無損失等的特點。
權利要求
1.一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特徵在於方法的步驟如下1)首先，將蚓激酶粗品溶於乙醇-水溶液中，配製粗酶質量百分比濃度為2～7％，乙醇體積百分比濃度為0～40％的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物；2)然後，取20mL上述混合溶液加入到預熱溫度為20～40℃高壓釜中，繼而通入預熱溫度為20～40℃，壓力為3.5～8.5MPa的加壓CO2同時攪拌，調節溶液的pH為4.4，在高壓下保持20～60分鐘，蚓激酶粗品中的雜蛋白在該條件下完全沉澱出來，而活性成分仍存留在溶液中，再將沉澱分離出去即可。
2.根據權利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特徵在於所說的高壓釜預熱溫度和CO2預熱溫度為25～35℃。
3.根據權利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特徵在於所說的CO2壓力為6.0～8.0MPa。
4.根據權利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特徵在於所說的酶質量百分比濃度為3～6％。
5.根據權利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特徵在於所說的乙醇溶液體積百分比濃度為15～35％。
6.根據權利要求1所述的一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法，其特徵在於所說的CO2壓力維持時間為30～50分鐘。
全文摘要
本發明公開了一種蚓激酶粗品中去除雜蛋白的方法。方法的步驟如下1)首先，將蚓激酶粗品溶於乙醇－水溶液中，配製粗酶質量百分比濃度為2～7％，乙醇體積百分比濃度為0～40％的溶液，反覆攪拌溶解後濾去不溶物；2)然後，取20mL上述混合溶液加入到預熱溫度為20℃～40℃高壓釜中，繼而通入預熱溫度為20℃～40℃，壓力為3.5～8.5MPa的加壓CO
文檔編號C12N9/64GK1587398SQ20041005404
公開日2005年3月2日 申請日期2004年8月24日 優先權日2004年8月24日
發明者姚善涇, 關怡新, 齊祥明 申請人:浙江大學