一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法及用途的製作方法

2023-09-16 12:12:25

專利名稱：：一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法及用途的製作方法
技術領域：
：本發明涉及生物工程領域，具體涉及保健食品生產和生物製藥技術，特指以葵花籽粕蛋白為原料，利用酶解技術製備水解多肽的製備方法及用途。
背景技術：
：葵花籽油是是繼棕櫚油、大豆油和菜籽油之後的第四大食用油，葵花籽粕是葵花籽制油時的副產物，其中含有29%-43%的優質蛋白質。但目前葵花籽粕一般僅用作飼料，沒有對其中的蛋白質作深加工利用。現代醫學研究證明，血管緊張素轉換酶(AngiotensinI-convertingenzyme,ACE)在體內血壓調節過程起重要作用。它使血管緊張素I轉化為有升壓作用的血管緊張素II並使有降壓作用的舒緩^:肽分解，從而使血壓升高。近年來人們從食品蛋白質開發出一類血管緊張素轉換酶抑制肽(ACE抑制肽)，給高血壓患者服用後可以抑制體內ACE的活性，達到降血壓的目的。在製備ACE抑制肽時，由於食品蛋白質在酶解為多肽的過程中產生大量的氫離子，但是要保證酶的活性必須保持反應體系中的pH值相對穩定，因此需要不斷加入鹽酸溶液或氫氧化鈉溶液來維持體系的pH值恆定；如果酶解是在鹼性或酸性的條件進行的，在酶解結束後還需要加入大量的氫氧化鈉溶液調節酶解液到中性。因此，在酶解後得到ACE抑制肽的粗提物中存在一定量的鈉鹽成分(主要為氯化鈉，一般含10n/。w/w左右)。高血壓與年齡、食鹽的攝取、體重、遺傳、性別、職業等多種因素有關。目前認為發生高血壓的外在條件是高鈉鹽的攝取，內在因素是腎臟功能的損傷。還有研究發現對食鹽的攝取是動脈血壓隨年齡而升高的條件。為此，一般高血壓患者都需要防止鈉鹽的過量攝入。所以作為給高血壓患者服用的ACE抑制肽，在製備過程中必須進行脫鹽處理。ACE抑制肽常用的脫鹽方法有活性碳吸附法、J3-環糊精包埋法、大孔樹脂吸附法和膜分離法等，不過處理起來都不僅很耗時，還大大增加了成本，而且活性多肽成分的損耗也很大。國內外關於從葵花粕中製備多肽僅有白羽等在《食品與機械》雜誌報導過，但該論文主要研究了酶解參數的篩選，沒有對多肽製備的脫鹽、乾燥等重要過程進行研究，而且對水解物也沒有進行功能定位。關於製備低鹽多肽的報導也很少，中國發明專利"低含鹽量的多肽生產方法"(申請號200610150150.6)採用三種蛋白酶順次水解牛羊鮮骨的方法，反應起始時用氫氧化鈉調節pH到鹼性，過程中不加鹼液，使得水解物中鹽含量較低；但這種方法仍然加入了一定量的鈉鹽，而且由於水解過程不控制pH值可能導致酶解反應效率下降。
發明內容本發明的目的克服現有多肽製備技術因脫鹽而造成工藝耗時長、成本高、多肽成分損耗大等不足，提供一種使用Ca(OH)2代替NaOH鹼溶酸沉法提取蛋白及在葵花籽粕蛋白酶解過程調節pH值、酶解結束中和酶解液中的酸，從而不需脫鹽就得到低鈉鹽葵花籽粕蛋白水解肽的方法。本發明上述目的是通過以下技術手段實現的:採用鹼溶酸沉法(以HC1溶液和Ca(OH)2溶液調節pH值)製備得到葵花籽粕蛋白，再將葵花籽粕蛋白按一定比例溶解於水，再用HC1溶液和Ca(OH)2溶液調節pH值到蛋白酶最適作用值，加入一定量蛋白酶在其最適作用條件下酶解適當時間，酶解結束後升溫到9(TC滅酶，再用Ca(OH)2溶液調節pH值到中性，通過過濾、濃縮和噴霧乾燥得到粉狀的葵花籽粕蛋白水解肽產品。上述方法中所說的鹼溶酸沉法製備葵花籽粕蛋白的方法為將葵花籽粕按料液比1:8-1:15(w/v)加入水，升溫至40-60。C，攪拌均勻，加入lmol/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在8.0-9.5，攪拌提取蛋白l-3h，用布袋離心機離心過濾，用lmol/L的HC1溶液調節濾液pH值到4.2，靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。上述方法中所說的酶解底物葵花籽粕蛋白的濃度為2%-10%(w/v)。上述方法中所說的酶解過程調節pH值的Ca(OH)2溶液濃度為0.5mol/L-lmol/L。上述方法中所說的酶解用蛋白酶為胰蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶或胃蛋白酶等常見的商品蛋白酶的一種或者其中兩種及兩種以上蛋白酶的組合。蛋白酶的用量以質量計為底物蛋白質量的1/60-1/20(w/w)，酶解的溫度37-60°C，pH為1.8-9.0，酶解反應時間為50-180min。上述方法中所說的酶解反應時間為50min到180min。上述方法中所說的對酶解液的滅酶過濾、濃縮和噴霧乾燥方法，是將酶解液加熱到90'C保持30s滅酶，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液並把濾液真空濃縮到乾物質濃度為30%(w/w)，再噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。本發明所具有的優點是採用Ca(OH)2溶液代替常用的NaOH溶液用於鹼溶酸沉法提取蛋白、在蛋白酶解過程中調節pH值和酶解結束中和酶解液中的酸，避免加入對高血壓患者有害的Na+，使製備過程不需要脫鹽，既保留了絕大部分活性成分，又簡化了工藝、降低了成本。圖1是本發明製備葵花籽粕蛋白水解肽的工藝流程圖。具體實施例方式下面結合實施例對本發明作進一步闡述，但本發明不限於下述實施例，對於本領域一般技術人員而言，在不背離本發明原理的前提下對它所做的任何顯而易見的改動，都屬於本發明的構思和所附權利要求的保護範圍。實施例l將葵花籽粕按料液比1:8(w/v)加入水，升溫至60'C,攪拌均勻，加入lmol/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在9.5,攪拌提取蛋白3h，用布袋式離心機離心過濾，用lmol/L的HCI溶液調節濾液pH值到4.2，靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。將40g葵花籽蛋白加入lOOOmL去離子水中混合均勻，形成4%(w/v)的蛋白溶液，升溫到50'C，再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2混懸液保持pH值8.0,先加入lg胰蛋白酶酶解50min，酶解結束後升溫到90'C保持30s滅酶，再用lmoI/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2溶液調節pH值到7.0，冷卻到室溫，取樣測定水解度和水解液對ACE抑制率。水解度表明蛋白質在酶的作用下水解程度，其測定採用中性甲醛滴定法(參照吳謀成編著《食品分析與感官評定》.北京:中國農業出版社,2002,pp.333.)，水解液多肽對ACE的抑制率表示其抑制ACE活性能力的大小，抑制率越高，其活性越大，一般在體內降血壓的能力也就越強。對ACE抑制率具體測定方法如下:先將5pL的ACE加入10pL已經用水稀釋20倍的酶解液樣品在37'C下恆溫5min，然後加入50jiL的6.5mmol/LHip-His-Leu(用100mmol/L的硼酸鹽緩衝液配製，含300mmol/L的NaCl，pH為8.3),在37'C下恆溫反應30min後加入85pL的lmol/LHC1溶液終止反應。用HPLC進行分析，記錄對應組分峰面積，同時用10pL100mmol/L、pH為8.3的硼酸鹽緩衝液作空白試驗。水解肽對ACE的抑制率可用下式計算式中i——水解液多肽對ACE的抑制率；」——空白對照組Hip的峰面積；S——多肽組Hip的峰面積。酶解液用布袋式離心機過濾後真空濃縮，再採用噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產n口Bo同時按照上述工藝條件進行對照的酶解反應製備葵花籽粕蛋白水解肽固體產品，僅把5調節pH用的0.5mol/L的Ca(OH)2改為lmo!/L的NaOH溶液。按照上述方法取樣測定酶解液的水解度和ACE抑制率。兩種方法製備葵花籽粕蛋白水解肽的結果對比如表1所示。表1Ca(OH)2與NaOH分別調節pH製備葵花籽粕蛋白水解肽的比較指標調節pH值的鹼液0.5mol/LCa(OH》lmol/LNaOH水解度(％)16.419.8酶解液ACE抑制率(％)68,843.7可見，採用Ca(OH)2調節pH值的葵花籽蛋白酶解液水解度略低，酶解液ACE抑制率明顯提高。因此，採用Ca(OH)2取代NaOH調節pH進行葵花籽蛋白葵花籽粕蛋白水解肽的製備是可行的，而且免脫鹽操作可以簡化工藝、節約成本。實施例2將葵花籽粕按料液比1:10(w/v)加入水，升溫至50'C，攪拌均勻，加入lmol/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在9.0，攪拌提取蛋白2h，用布袋式離心機離心過濾，用lmol/L的HCl溶液調節濾液pH值到4.2,靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。將100g葵花籽蛋白加入1000mL去離子水中混合均勻，形成10%(w/v)的蛋白溶液，升溫到50'C，再用lmol/L的HC1溶液和lmol/L的Ca(OH)2混懸液保持pH值8.0，加入2.5g胰蛋白酶酶解60min，再用lmol/L的HC1溶液和lmol/LCa(OH)2混懸液調節pH到7.0,升溫到60'C加入2.5g中性蛋白酶酶解120min。酶解結束後升溫到90'C保持30s滅酶，再用lmol/L的HC1溶液和lmol/L的Ca(OH)2溶液調節pH值到7.0,冷卻到室溫，取樣按照實施例1中的方法測定水解度和水解液對ACE抑制率。酶解液用布袋式離心機過濾後真空濃縮，再採用噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。同時按照上述工藝條件進行對照的酶解反應製備葵花籽粕蛋白水解肽固體產品，僅把調節pH用的lmol/L的Ca(OH)2改為2mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取樣測定酶解液的水解度和ACE抑制率。兩種方法製備葵花籽粕蛋白水解肽的結果對比如表2所示。表2Ca(OH)2與NaOH分別調節pH製備葵花籽粕蛋白水解肽的比較指標調節pH值的鹼液lmol/LCa(OH)22mol/LNaOH水解度(％)21.823.1酶解液ACE抑制率(％)82.773.4可見，採用Ca(OH)2調節pH值的葵花籽蛋白酶解液水解度略低，酶解液的ACE抑制率較高。所以可以採用Ca(OH)2取代NaOH調節pH進行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽製備，而且採用Ca(OH)2調節pH值可以免除脫鹽操作，從而簡化工藝、節約成本。實施例3將葵花籽粕按料液比1:12(w/v)加入水，升溫至40°C，攪拌均勻，加入lmoi/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在8.5,攪拌提取蛋白1.5h，用布袋式離心機離心過濾，用lmoI/L的HC1溶液調節濾液pH值到4.2，靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。將20g葵花籽粕蛋白加入1000mL去離子水中混合均勻，形成2%(w/v)的蛋白溶液，升溫到50°C,再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2混懸液調節pH值9.0，加入0.34g鹼性蛋白酶酶解90min。酶解結束後升溫到90'C保持30s滅酶，再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2溶液調節pH值到7.0,冷卻到室溫，取樣按照實施例1中的方法測定水解度和水解液對ACE抑制率。酶解液用布袋式離心機過濾後真空濃縮，再採用噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。同時按照上述工藝條件進行對照的酶解反應製備葵花籽粕蛋白水解肽固體產品，僅把調節pH用的0.5mol/LCa(OH)2改為lmol/L的NaOH溶液。按照上述方法取樣測定酶解液的水解度和ACE抑制率。兩種方法製備葵花籽粕蛋白水解肽的結果對比如表3所示。表3Ca(OH)2與NaOH分別調節pH製備葵花籽粕蛋白水解肽的比較tableseeoriginaldocumentpage7可見，兩種鹼液調節pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度和ACE抑制率相似，採用Ca(OH)2取代NaOH調節pH進行葵花籽粕蛋白水解肽的製備可行，而且不用產品脫鹽，可簡化工藝、節約成本。實施例4將葵花籽粕按料液比1:15(w/v)加入水，升溫至50'C,攪拌均勻，加入lmol/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在8.0，攪拌提取蛋白lh，用布袋式離心機離心過濾，用lmol/L的HCl溶液調節濾液pH值到4.2，靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。將50g葵花籽粕蛋白加入1000mL去離子水中混合均勻，形成5%(w/v)的蛋白溶液，升溫到60°C，再用lmol/L的HC1溶液和0.75mol/L的Ca(OH)2混懸液調節並保持pH值6.0，加入lg木瓜蛋白酶酶解120min。酶解結束後升溫到90'C保持30s滅酶，冷卻到室溫，取樣按照實施例1中的方法測定水解度和水解液對ACE抑制率。酶解液用布袋式離心機過濾後真空濃縮，再採用噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。同時按照上述工藝條件進行對照的酶解反應製備葵花籽粕蛋白水解肽固體產品，僅把調節pH用的0.75mol/LCa(OH)2改為1.5mol/L的NaOH溶液。按照上述方法取樣測定酶解液的水解度和ACE抑制率。兩種方法製備葵花籽粕蛋白水解肽的結果對比如表4所示。表4Ca(OH)2與NaOH分別調節pH製備葵花籽粕蛋白水解肽的比較tableseeoriginaldocumentpage8可見，兩種鹼液調節pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度和ACE抑制率相似，採用Ca(OH)2取代NaOH調節pH進行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽的製備不僅可行，而且因不用脫鹽，可簡化工藝、節約成本。實施例5將葵花籽粕按料液比1:10(w/v)加入水，升溫至45°C，攪拌均勻，加入lmol/L的Ca(0—H)2溶液調節溶液pH保持在9.0,攪拌提取蛋白2h，用布袋式離心機離心過濾，用lmol/L的HCl溶液調節濾液pH值到4.2，靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。將30g葵花籽粕蛋白加入lOOOmL去離子水中混合均勻，形成3%(w/v)的蛋白溶液，升溫到37'C，再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2混懸液調節並保持pH值1.8，加入lg胃蛋白酶酶解120min。酶解結束後升溫到90'C保持30s滅酶，再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2溶液調節pH值到7.0,冷卻到室溫，取樣按照實施例1中的方法測定水解度和水解液對ACE抑制率。酶解液用布袋式離心機過濾後真空濃縮，再採用噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。同時按照上述工藝條件進行對照的酶解反應製備葵花籽粕蛋白水解肽固體產品，僅把調節pH用的0.5mol/LCa(OH)2改為lmol/L的NaOH溶液。按照上述方法取樣測定酶解液的水解度和ACE抑制率。兩種方法製備葵花籽粕蛋白水解肽的結果對比如表5所示。表5Ca(OH)2與NaOH分別調節pH製備葵花籽粕蛋白水解肽的比較tableseeoriginaldocumentpage8tableseeoriginaldocumentpage9可見，兩種鹼液調節pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度和ACE抑制率相似，採用Ca(OH)2取代NaOH調節pH進行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽的製備不僅可行，而且因不用脫鹽，可簡化工藝、節約成本。實施例6將葵花籽粕按料液比1:12(w/v)加入水，升溫至50°C，攪拌均勻，加入lmol/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在8.5，攪拌提取蛋白1.5h，用布袋式離心機離心過濾，用lmol/L的HC1溶液調節濾液pH值到4.2,靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。將50g葵花籽粕蛋白加入1000mL去離子水中混合均勻，形成5%(w/v)的蛋白溶液，升溫到50°C,再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH》混懸液調節並保持pH值9.0，加入lg鹼性蛋白酶酶解60min，再調節到pH值8.0，加入0.5g胰蛋白酶酶解60min，再用lmol/LCa(OH)2混懸液調節pH到7.0，升溫到60'C加入0.5g中性蛋白酶酶解60min。酶解結束後升溫到90'C保持30s滅酶，再用lmol/L的HC1溶液和0.5mol/L的Ca(OH)2溶液調節pH值到7.0，冷卻到室溫，取樣按照實施例1中的方法測定水解度和水解液對ACE抑制率。酶解液用布袋式離心機過濾後真空濃縮，再採用噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。同時按照上述工藝條件進行對照的酶解反應製備ACE抑制肽固體產品，僅把調節pH用的0.5mol/LCa(OH)2改為lmol/L的NaOH溶液。按照上述方法取樣測定酶解^t的水解度和ACE抑制率。兩種方法製備ACE抑制肽的結果對比如表6所示。表6Ca(OH)2與NaOH分別調節pH製備葵花籽粕蛋白水解肽的比較tableseeoriginaldocumentpage9由表6可見，兩種鹼液調節pH值的葵花籽粕蛋白酶解液水解度相近，採用Ca(OH)2調節的ACE抑制率略高，採用Ca(OH)2取代NaOH調節pH進行葵花籽粕蛋白ACE抑制肽的製備不僅可行，而且由於不用脫鹽，可簡化工藝、節約成本。權利要求1.一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法，其特徵在於按照下述步驟進行採用鹼溶酸沉法製備得到葵花籽粕蛋白，將葵花籽粕蛋白以一定的濃度溶解於水，再用HCl溶液和Ca(OH)2溶液調節pH值到蛋白酶最適作用值，加入一定量蛋白酶在其最適作用條件下酶解適當時間，酶解結束後升溫到90℃滅酶，再用Ca(OH)2溶液調節pH值到中性，再自然冷卻到室溫，用布袋式離心機過濾酶解液並把濾液真空濃縮到乾物質濃度以質量計為30％，再噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品；其中所述鹼溶酸沉法製備得到葵花籽粕蛋白步驟如下將葵花籽粕按料液比1∶8-1∶15(w/v)加入水，升溫至40-60℃，攪拌均勻，加入1mol/L的Ca(OH)2溶液調節溶液pH保持在8.0-9.5，攪拌提取蛋白1-3h，用布袋離心機離心過濾，用1mol/L的HCl溶液調節濾液pH值到4.2，靜置過夜，離心，將沉澱物噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白。2.根據權利要求1所述的一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法，其特徵在於酶解底物葵花籽粕蛋白的濃度為以質量與體積比計2%40%。3.根據權利要求1所述的一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法，其特徵在於酶解過程調節pH用的Ca(OH)2溶液濃度為0.5moI/L-lmoI/L。4.根據權利要求l所述的一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法，其特徵在於酶解用酶為胰蛋白酶、中性蛋白酶、鹼性蛋白酶或胃蛋白酶中的一種或者其中兩種及兩種以上蛋白酶的組合，蛋白酶的用量以質量計為底物蛋白質量的1/60-1/20,酶解的溫度37-60。C，pH為1.8-9.0,酶解反應時間為50-180min。5.—種葵花籽粕蛋白水解肽的用途，其特徵在於可用於製備抑制體內血管緊張素轉換酶的活性藥物。6.—種葵花籽粕蛋白水解肽的用途，其特徵在於可用於製備抑制體內血管緊張素轉換酶的活性的保健食品。全文摘要一種製備葵花籽粕蛋白水解肽的新方法及用途，涉及生物工程領域。按照下述步驟進行採用鹼溶酸沉法(以HCl溶液和Ca(OH)2溶液調節pH值)製備得到葵花籽粕蛋白，將葵花籽粕蛋白以一定的濃度溶於水，再用HCl溶液和Ca(OH)2溶液調節pH值到蛋白酶最適作用值，加入一定量蛋白酶在其最適作用條件下酶解適當時間，酶解結束後升溫到90℃滅酶，再用Ca(OH)2溶液調節pH值到中性，通過過濾、濃縮和噴霧乾燥得到葵花籽粕蛋白水解肽產品。本發明採用Ca(OH)2溶液代替常用的NaOH溶液，避免加入對高血壓患者有害的Na+，使製備過程不需要脫鹽，保留了大部分活性成分，簡化了工藝、降低了成本。利用該方法製得的葵花籽粕蛋白水解肽可以用於製備抑制體內血管緊張素轉換酶活性的藥物或者保健食品。文檔編號C12P21/06GK101633947SQ20091018459公開日2010年1月27日申請日期2009年8月31日優先權日2009年8月31日發明者何榮海,婷王,馬海樂申請人:江蘇大學